Isolement, caractérisation et Purification des Macrophages dans les tissus touchés par l’Inflammation associées à l’obésité
Summary
Ce protocole permet un chercheur d’isoler et de caractériser les tissus-résident hallmark de macrophages dans divers tissus enflammés extraites de modèles induite par le régime alimentaire des troubles métaboliques.
Abstract
L’obésité favorise un état inflammatoire chronique qui est largement médiatisé par les macrophages tissulaires-résident ainsi que les macrophages dérivés de monocytes. L’obésité induite par l’alimentation (DIO) est un modèle précieux pour l’étude du rôle de l’hétérogénéité des macrophages ; Cependant, des isolations de macrophage adéquates sont difficiles à acquérir à partir de tissus enflammés. Dans ce protocole, nous décrivons les étapes de l’isolement et les directives de dépannage nécessaires provenant de nos études pour obtenir une population convenable des macrophages de tissu-résident de souris après 18 semaines de haute teneur en graisses (HFD) ou de la haute-graisse/riche en cholestérol ( Intervention HFHCD) de régime. Ce protocole se concentre sur trois tissus de hallmark étudiés dans l’obésité et l’athérosclérose y compris le foie, le tissu adipeux blanc (WAT) et l’aorte. Nous mettons en évidence l’utilisation comment dualiste de l’écoulement cytometry peut atteindre une nouvelle dimension de l’isolement et la caractérisation des macrophages de tissu-résident. Un article fondamental du présent protocole aborde les subtilités qui sous-tendent les digestions enzymatiques spécifiques des tissus et l’isolement de macrophage et ultérieures anticorps de surface cellulaire coloration pour cytométrie. Ce protocole traite des complexités existantes qui sous-tendent la cellule activée par fluorescence triant (FACS) et présente des éclaircissements à ces complexités afin d’obtenir la caractérisation de la vaste gamme de populations cellulaires correctement trié. Méthodes d’enrichissement de rechange sont inclus pour le tri des cellules, comme le foie dense, permettant la gestion de la flexibilité et l’heure lorsque vous travaillez avec des FACS. En bref, ce protocole facilite le chercheur pour évaluer l’hétérogénéité des macrophages d’une multitude de tissus enflammés dans une étude donnée et fournit des conseils de dépannage perspicaces qui ont réussi pour la caractérisation et l’isolement cellulaire favorable des cellules immunitaires dans l’inflammation induite par la DIO.
Introduction
Modèles de souris ont été largement utilisés pour étudier la dynamique des maladies humaines. Isolation correcte des cellules résidentes des souris dans un état de malade peut fournir une plate-forme pour comprendre les contributions moléculaires et cellulaires à la pathogenèse de la maladie1. Un trouble qui est d’une importance cruciale est l’obésité. L’incidence de l’obésité continue d’augmenter dans le monde entier en parallèle avec la résistance à l’insuline et le type 2 mellitus de diabète, maladies cardiovasculaires et stéatose hépatique2,3. Une consommation excessive en éléments nutritifs est plus biaisée par la diminution de l’activité physique déclenchant des signaux altérés provenant du tissu adipeux, ce qui peut modifier le milieu cellulaire des autres tissus périphériques tels que l’ aorte et le foie4. Ces perturbations de l’homéostasie métabolique se traduit par une inflammation systémique de chroniques de bas grade5.
Classique activation des macrophages résidents à l’aorte et du foie ainsi que leur recrutement dans le tissu adipeux blanc (WAT) s’est avérée non seulement lancer le dérèglement des signaux métaboliques mais également soutenir l’inflammation6,7. L’hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle des macrophages est fortement liée à la pathogenèse de l’obésité des comorbidités7. La plasticité dynamique en polarisation macrophage permet ces cellules présentent un éventail des phénotypes activés qui coordonnent la progression et la résolution de l’inflammation,8. Tandis que les macrophages activés de façon classique (M1) sont impliqués dans la propagation de l’inflammation, alternativement activés macrophages (M2) ont été associés à la résolution et le tissu réparation9,10.
Comme le corps subit des stress métabolique, le tissu adipeux blanc s’accumule anormalement. Le tissu adipeux élargi attire et retient les cellules inflammatoires qui modifient profondément les fonction d’adipocyte normal pour favoriser la résistance à l’insuline, hyperglycémie et diabète de type 2 en fin de compte, insulinorésistance ou hyperglycémie11, 12. En parallèle, le tissu adipeux blanc remodèle en réponse à des signaux inflammatoires libérés par infiltré classiquement activés (M1) du tissu adipeux macrophages (ATMs)13,14. Cet organe multicellulaire exerce une cascade de signaux qui déraille la fonction normale des autre organes du corps humain tels que l’aorte et du foie4.
Le foie est un puissant métabolique qui s’adapte en réponse à des stimuli provenant du voisin dysrégulation WAT15. Macrophages hépatiques ou des cellules de Kupffer, en réponse à des changements métaboliques, sécrètent des cytokines inflammatoires qui transforment les deux parenchymateuses et phénotype cellulaire non parenchymateuses et promouvoir le remodelage tissulaire. Accumulation de lipides hépatiques, inflammation, dépôts excessifs de la matrice extracellulaire, nécrose et fonction éventuelle perte suit les insultes inflammatoires qui contribuent à la vaste gamme d’atteinte hépatique associées non alcoolisées stéatose hépatique 16,17,18.
Parallèlement au WAT compromise et la fonction hépatique, grosses artères s’accumulent des lipides dans la paroi artérielle que le corps subit un stress métabolique chronique19. Accumulation de lipides artérielle déclenche la sécrétion de chimiokines par les cellules endothéliales activées et le recrutement des monocytes20. Une fois recrutés, monocytes prolifèrent, se différencient, ingèrent des lipoprotéines et deviennent des cellules spumeuses. Athérogenèse est initiée et soutenue par l’activité pro-inflammatoire des recrutés et les tissus résident macrophages chargés de lipides. Succomber aux signaux extracellulaires et intracellulaires stress relayés dans ce micro-environnement athérogène, ces macrophages puis s’engager dans une apoptose cascade de signalisation. Comme ces cellules meurent, elles contribuent à leur teneur en lipides rempli au noyau nécrotique de la lésion, ce qui mène à la rupture de plaque, infarctus du myocarde et accident vasculaire cérébral.
Collectivement, l’hétérogénéité des phénotypes macrophage orchestre en partie l’obésité induite par les changements inflammatoires observées dans les tissus de dysrégulation tels que WAT, foie et aorte8,21. Caractérisation des recrutés et macrophages résident tissulaires pourraient donner un aperçu de potentielles cibles moléculaires qui manipulent des macrophages phénotype1. Afin de caractériser efficacement les macrophages des tissus enflammés induites par l’obésité, une suspension de cellules individuelles peut être obtenue par digestion enzymatique. Ces protocoles de dissociation doivent être efficaces dans la dégradation suffisamment de tissu conjonctif tout en minimisant la mort des cellules immunitaires et fournir le rendement cellulaire optimal. Le mélange d’enzymes est dépendant du type de tissu et son maquillage structurelle. Tissus résistants tels que l’aorte nécessite plus forte activité enzymatique, par rapport au foie et WAT, pour atteindre la dissociation tissulaire. De la suspension monocellulaire, macrophages résident tissulaires peuvent être sans ambiguïté caractérise ou isolés pour approfondir les analyses en aval comme le profilage transcriptionnel.
Ici est décrit un protocole tissu-spécifique qui utilise la digestion de collagénase dépendant des tissus et cytométrie polychromatique pour effectivement isoler et de caractériser des macrophages de tissu-résident provenant du régime alimentaire traditionnel induites par l’obésité, l’athérosclérose, simple stéatose et stéato-hépatite modèles murins. Simultanée de la coloration des marqueurs de surface de cellules avec des anticorps dirigés contre les leucocytes-(CD45 et/ou CD11b) et macrophage – antigènes spécifiques (F4/80) est souvent utilisé pour identifier les populations de macrophage22. Cellule activée par fluorescence triant (FACS) est une stratégie puissante permet de trier ces populations identifiées à haute pureté. La population triée peut ensuite être évaluée pour profils de gènes spécifiques de phénotype à l’aide de l’analyse moléculaire en aval (par exemple la PCR quantitative en temps réel)23. Bien que standard cytométrie en flux et tri de cellule axée sur la cytométrie en flux sont des outils puissants pour distinguer les macrophages dans une suspension de cellules très hétérogène, anciens protocoles doivent être optimisés pour assurer une sortie réussie. Dans cette étude, les protocoles qui effectivement isoler et caractérisent les macrophages des tissus viables sont décrits ; plus important encore, cette étude donne un aperçu crucial de questions techniques qui se posent souvent, ainsi que des stratégies proactives et dépannage afin d’éviter et/ou de les résoudre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modèles de trouble métabolique induite par l’alimentation qui imitent des co-morbidités telles que l’athérosclérose, la stéatose simple, stéato-hépatite et diabète de type 2 sont largement utilisés pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents de la progression de la maladie. La charge digestion de collagénase est souvent utilisée pour dissocier les tissus pour libérer les cellules de la matrice extracellulaire (ECM)16,27. Enzy…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Flow Cytometry Core Facility à The Pennsylvania State Université millénaire Science complexe.
Materials
| 26G x 5/8 in Needles | BD | 305115 | |
| 23G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set | BD | 367297 | Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion |
| 21G 1 1/2 in. Needles | BD | 305156 | |
| 1mL syringe with rubber stops | BD | 309659 | |
| 10mL Syringes | BD | 309604 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| F4/80 PE | Biolegend | 123110 | |
| CD11c PE/Cy7 | Biolegend | 117318 | |
| CD11b PE/Cy5 | eBioscience | 15-0112-81 | |
| Anti-mouse CD16/32 Fc Block | Biolegend | 101320 | |
| CD45 Pacific Blue | Biolegend | 103126 | |
| PE Rat IgG2a | Biolegend | 400508 | |
| PE/Cy7 Armenian Hamster IgG | Biolegend | 400922 | |
| PE/Cy5 Rat IgG2b | Biolegend | 400610 | |
| Pacific Blue Rat IgG2c | Biolegend | 400717 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 15-017-CV | |
| 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro | 21-031-CV | |
| 70 micron cell strainers | Corning, Inc. | 352350 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16X | Electron Microscopy Sciences | CAS #30525-89-4 | |
| Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23mm, Sharp | Stoelting | 52132-10P | Used for general dissecting purposes |
| Micro Forceps, 4in, full curve, 0.8mm | Stoelting | 52102-37P | Used for general dissecting purposes |
| Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge | Fine Science Tool | 15000-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
| Curved 0.07 x 0.04 mm Tip Forceps | Fine Science Tool | 11297-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
| Hemostatic Forceps (Curved) | Fine Science Tool | 13021-12 | |
| Heparin Sodium Salt | Fischer Scientific | 9041-08-1 | |
| 35mm Cell Culture/Petri Dishes | Fischer Scientific | 12-565-90 | |
| Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid | Fischer Scientific | 08-757-100D | |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-959-53A | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| 5mL Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fischer Scientific | 14-959-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) | Millipore | EX0285-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Rockland | BSA-50 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Collagenasse Type XI | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Hyaluronidase Type I | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| 500mL beaker | Sigma Aldrich | 02-540M | |
| 4 cm Hemostatic clamp | Stoelting | 52120-40 | |
| Toothed forceps | Stoelting | 52104-33P | |
| 50 micron Disposable filters | Systemex | 04-0042-2317 | |
| Collagenase Type IV | ThermoFischer Scientific | 17104019 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) | ThermoFischer Scientific | A1049201 | |
| Razors (0.22 mm (0.009")) | VWR International | 55411-050 | |
| Texas Red Live/Dead stain | Red viability stain (in Figure 1A) |
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