Isolierung, Charakterisierung und Reinigung der Makrophagen aus den Geweben von Fettleibigkeit bedingte Entzündung betroffen
Summary
Dieses Protokoll ermöglicht ein Forscher zu isolieren und zu charakterisieren, Gewebe-Bewohner Makrophagen in verschiedenen hallmark entzündetem Gewebe extrahiert aus Diät-induzierten Modelle der Stoffwechselstörungen.
Abstract
Übergewicht fördert einen chronische entzündlichen Zustand, der weitgehend durch Gewebe-Bewohner Makrophagen sowie Monocyte abgeleiteten Makrophagen vermittelt wird. Diät-induzierten Adipositas (DIO) ist ein wertvolles Modell bei der Untersuchung der Rolle der Makrophagen Heterogenität; angemessene Makrophagen Isolationen sind jedoch schwierig, von entzündetem Gewebe zu erwerben. In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung Schritte und notwendigen Lösungsanleitungen stammen aus unseren Studien eine geeignete Bevölkerung von Gewebe-Bewohner Makrophagen von Mäusen nach 18 Wochen der fettreichen (HFD) oder High-Fat/High-Cholesterin (einzuholen HFHCD) Diät Intervention. Dieses Protokoll konzentriert sich auf drei Markenzeichen Gewebe untersucht Adipositas und Arteriosklerose einschließlich der Leber, weißen Fettgewebe (WAT) und der Aorta. Wir markieren wie dualistische Nutzung des Flow Cytometry erreichen eine neue Dimension der Isolierung und Charakterisierung von Gewebe-Bewohner Makrophagen. Ein grundlegenden Abschnitt dieses Protokolls befasst sich mit die Feinheiten gewebespezifischen enzymatischen Verdauung und Makrophagen Isolierung und anschließende Zelloberfläche Antikörper Färbung für durchflusszytometrischen Analyse zugrunde liegen. Dieses Protokoll befasst sich mit vorhandenen Komplexität zugrunde liegende fluoreszierende aktiviert Zelle sortieren (FACS) und enthält Erläuterungen zu diesen komplexen Problemen um breite Palette Charakterisierung von angemessen sortierte Zellpopulationen zu erhalten. Dazu gehören Alternative Anreicherungsverfahren für das Sortieren von Zellen, wie die dichten Leber, ermöglichen Flexibilität und Zeit bei der Arbeit mit FACS. Kurz gesagt, dieses Protokoll aids-Forscher, Makrophagen Heterogenität aus einer Vielzahl von entzündetem Gewebe in einer bestimmten Studie zu bewerten und liefert aufschlussreiche Tipps zur Problembehandlung, die erfolgreich für günstige zellulären Isolierung und Charakterisierung von Immunzellen in DIO-vermittelte Entzündung.
Introduction
Maus-Modellen sind weitgehend benutzt worden, um die Dynamik der menschlichen Krankheiten zu studieren. Richtige Isolierung der ansässigen Gewebezellen von Mäusen in einem kranken Zustand kann eine Plattform bieten, für das Verständnis der molekularen und zellulären Beiträge zur Pathogenese einer Krankheit1. Eine Störung, die von entscheidender Bedeutung ist Übergewicht. Die Inzidenz der Adipositas weiter steigen weltweit parallel mit Insulinresistenz und Typ-2 Diabetes Mellitus, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Fettleber2,3. Übermäßiger Konsum Nährstoff ist weiter verzerrt durch verminderte körperliche Aktivität auslösen veränderten Signale aus Fettgewebe, die das zelluläre Milieu von anderen peripheren Geweben wie der Aorta und Leber4verändern können. Solche Störungen der metabolischen Homöostase führt eine chronische niedriggradigen systemischen Entzündung5.
Klassische Aktivierung von Makrophagen wohnhaft sind, um die Aorta und Leber sowie ihre Einstellung zu weißen Fettgewebe (WAT) nachweislich nicht nur Dysregulation von metabolischen Signalen zu initiieren, sondern auch nachhaltig Entzündung6,7. Die phänotypische und funktionelle Heterogenität von Makrophagen ist stark verbunden mit der Entstehung von Übergewicht im Zusammenhang mit Komorbiditäten7. Die dynamische Plastizität in Makrophagen Polarisierung ermöglicht diese Zellen eine Reihe von aktivierten Phänotypen, die das Fortschreiten zu koordinieren und Auflösung der Entzündung8auszustellen. Während klassisch aktivierte Makrophagen (M1) in der Ausbreitung der Entzündung beteiligt sind, wurden Alternativ aktivierte Makrophagen (M2) mit Auflösung und Gewebe Reparatur9,10verbunden.
Wie der Körper metabolische Belastung erfährt, sammelt sich ungewöhnlich weißen Fettgewebe. Das erweiterte Fettgewebe anzieht und behält sich Entzündungszellen, die normalen Adipocyte Funktion zur Förderung der Insulinresistenz, Hyperglykämie und letztlich Typ-2 Diabetes Mellitus, Insulin-Resistenz oder Hyperglykämie11tiefgreifend verändern, 12. Parallel infiltriert weißen Fettgewebe umbaut in Reaktion auf inflammatorische Signale veröffentlicht von klassisch aktivierte (M1) Fettgewebe Makrophagen (ATMs)13,14. Diese mehrzellige Organ übt eine Kaskade von Signalen, die die normale Funktion der anderen Organe des Körpers wie die Aorta und Leber4entgleist.
Die Leber ist eine metabolische Kraftwerk, das als Reaktion auf Reize aus nahe gelegenen Dysregulated WAT15passt. Hepatische Makrophagen oder Kupffer Zellen als Reaktion auf metabolische Veränderungen, sezernieren inflammatorischen Zytokinen, die beide parenchymatösen verwandeln und nicht parenchymatösen Zelle Phänotyp und fördern Gewebe umgestaltet. Hepatische Lipid Akkumulation, Entzündung, übermäßige extrazelluläre Matrix Einlagen, Nekrose und eventuelle Funktion Verlust folgt die entzündlichen Beleidigungen beitragen, das breite Spektrum der Leberschäden im Zusammenhang mit nicht-alkoholische Fettleber 16,17,18.
Parallel zu kompromittierten WAT und Leberfunktion akkumulieren große Arterien Lipiden in der Arterienwand, wie der Körper chronischer metabolischer Stress19 erfährt. Arterielle Lipid Ansammlung löst die Sekretion von Chemokinen durch aktivierten Endothelzellen und spätere Rekrutierung von Monozyten20. Einmal eingestellt, vermehren Monozyten, differenzieren, Lipoproteine aufnehmen und zu Schaumzellen. Atherogenese initiiert und getragen von der Pro-inflammatorischen Aktivität von rekrutiert und Gewebe resident Lipid-beladene Makrophagen. Die extrazellulären und intrazellulären Stress-Signale weitergeleitet in diesem atherogenic Mikroumgebung erliegen, diese Makrophagen dann in eine Signalkaskade Apoptotic engagieren. Wenn diese Schaumzellen sterben, tragen sie ihre Lipid gefüllt Inhalte zum nekrotischen Kern der Läsion, die dann zu Plaque Ruptur, Herzinfarkt und Schlaganfall führt.
Die Heterogenität der Makrophagen Phänotypen orchestriert Kollektiv, teilweise die Adipositas induziert durch entzündliche Veränderungen in Dysregulated Gewebe wie WAT, Leber und Aorta8,21. Charakterisierung von rekrutiert und resident Gewebe Makrophagen konnte Einblick in mögliche molekulare Targets, die Makrophagen Phänotyp1bearbeiten. Um Makrophagen von Adipositas-induzierte entzündetem Gewebe effektiv zu charakterisieren, erhalten Sie eine einzellige Suspension durch enzymatische Verdauung. Solche Protokolle Dissoziation müssen ausreichend erniedrigende Bindegewebe bei gleichzeitiger Minimierung immun Zelltod und bietet optimale Zellausbeute wirksam. Die Enzym-Mischung ist abhängig von der Art des Gewebes und seiner strukturellen Make-up. Elastische Gewebe wie der Aorta erfordert stärkere enzymatische Aktivität im Vergleich zu der Leber und WAT Gewebe Dissoziation zu erreichen. Aus der Einzelzelle Suspension können Gewebe resident Makrophagen eindeutig gekennzeichnet oder isoliert für weitere nachgelagerte Analysen wie transkriptionelle Profilierung.
Hier ist eine gewebespezifische Protokoll beschrieben, die Kollagenase-abhängige Gewebe Verdauung und polychromatische Durchflusszytometrie verwendet, um effektiv zu isolieren und zu charakterisieren Gewebe-Bewohner Makrophagen aus traditionellen Ernährung induzierten Adipositas gewonnen, Arteriosklerose, einfache Steatose und Steatohepatitis Mausmodellen. Gleichzeitige Färbung der Zelle Oberflächenmarker mit Antikörpern gegen Leukozyten-(CD45 und/oder CD11b) und Makrophagen – spezifische Antigene (F4/80) wird häufig verwendet um Makrophagen Populationen22zu identifizieren. Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) ist eine wirkungsvolle Strategie verwendet, um diese identifizierten Populationen in hoher Reinheit zu sortieren. Die sortierte Bevölkerung kann dann für Phänotyp spezifischen Gen-Profile mit nachgeschalteten molekulare Analyse (z. B. quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion)23ausgewertet werden. Obwohl standard Durchflusszytometrie und Flow Cytometry-basierte Zellsortierung mächtige Werkzeuge in Makrophagen in einem stark heterogenen Zellsuspension zu unterscheiden sind, müssen der ehemaligen Protokolle optimiert werden, um erfolgreichen Ausgang zu gewährleisten. In dieser Studie sind Protokolle, die effektiv zu isolieren und zu charakterisieren bestimmte tragfähige Gewebe Makrophagen beschrieben; noch wichtiger ist, bietet diese Studie entscheidende Einblicke in technische Probleme, die häufig sowie proaktive und Fehlersuche Strategien zu verhindern bzw. zu lösen auftreten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diät-induzierten Stoffwechselstörung Modelle, die Komorbiditäten wie Atherosklerose, einfache Steatose, Steatohepatitis zu imitieren und Typ-2-Diabetes, sind weitgehend verwendet, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Progression der Erkrankung besser zu verstehen. Kollagenase abhängigen Verdauung wird häufig verwendet, Gewebe, Zellen aus der extrazellulären Matrix (ECM)16,27zu befreien zu distanzieren. Enzyme wie Kollagenase stören Kollage…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten den Flow Cytometry Core Facility in The Pennsylvania State University Millennium Science Complex danken.
Materials
| 26G x 5/8 in Needles | BD | 305115 | |
| 23G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set | BD | 367297 | Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion |
| 21G 1 1/2 in. Needles | BD | 305156 | |
| 1mL syringe with rubber stops | BD | 309659 | |
| 10mL Syringes | BD | 309604 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| F4/80 PE | Biolegend | 123110 | |
| CD11c PE/Cy7 | Biolegend | 117318 | |
| CD11b PE/Cy5 | eBioscience | 15-0112-81 | |
| Anti-mouse CD16/32 Fc Block | Biolegend | 101320 | |
| CD45 Pacific Blue | Biolegend | 103126 | |
| PE Rat IgG2a | Biolegend | 400508 | |
| PE/Cy7 Armenian Hamster IgG | Biolegend | 400922 | |
| PE/Cy5 Rat IgG2b | Biolegend | 400610 | |
| Pacific Blue Rat IgG2c | Biolegend | 400717 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 15-017-CV | |
| 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro | 21-031-CV | |
| 70 micron cell strainers | Corning, Inc. | 352350 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16X | Electron Microscopy Sciences | CAS #30525-89-4 | |
| Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23mm, Sharp | Stoelting | 52132-10P | Used for general dissecting purposes |
| Micro Forceps, 4in, full curve, 0.8mm | Stoelting | 52102-37P | Used for general dissecting purposes |
| Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge | Fine Science Tool | 15000-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
| Curved 0.07 x 0.04 mm Tip Forceps | Fine Science Tool | 11297-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
| Hemostatic Forceps (Curved) | Fine Science Tool | 13021-12 | |
| Heparin Sodium Salt | Fischer Scientific | 9041-08-1 | |
| 35mm Cell Culture/Petri Dishes | Fischer Scientific | 12-565-90 | |
| Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid | Fischer Scientific | 08-757-100D | |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-959-53A | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| 5mL Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fischer Scientific | 14-959-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) | Millipore | EX0285-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Rockland | BSA-50 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Collagenasse Type XI | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Hyaluronidase Type I | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| 500mL beaker | Sigma Aldrich | 02-540M | |
| 4 cm Hemostatic clamp | Stoelting | 52120-40 | |
| Toothed forceps | Stoelting | 52104-33P | |
| 50 micron Disposable filters | Systemex | 04-0042-2317 | |
| Collagenase Type IV | ThermoFischer Scientific | 17104019 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) | ThermoFischer Scientific | A1049201 | |
| Razors (0.22 mm (0.009")) | VWR International | 55411-050 | |
| Texas Red Live/Dead stain | Red viability stain (in Figure 1A) |
References
- Davies, L. C., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages: Then and Now. Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (12), 840-846 (2006).
- Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (12), 875-880 (2006).
- Jung, U., Choi, M. -. S. Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Int J Mol Sci. 15 (4), 6184-6223 (2014).
- Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome. Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).
- Vieira-Potter, V. J. Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues. Cell Microbiol. 16 (10), 1484-1492 (2014).
- Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 738-749 (2011).
- Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages. Front Immunol. 5 (1), 1-15 (2015).
- Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. Macrophages at the fork in the road to health or disease. Front Immunol. 6 (2), 1-6 (2015).
- Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5 (8), 1-22 (2014).
- Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (5), 367-377 (2008).
- Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (3), 262-277 (2014).
- Fujisaka, S., Usui, I., et al. Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice. Diabetes. 58 (9), 2574-2582 (2009).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).
- Qureshi, K., Abrams, G. A. Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 13 (26), 3540-3553 (2007).
- Bedossa, P., Paradis, V. Liver extracellular matrix in health and disease. J Pathol. 200 (4), 504-515 (2003).
- Tilg, H., Moschen, A. R. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis. Hepatology. 52 (5), 1836-1846 (2010).
- Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
- Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. Int J Obesity. 26 (12), 754-764 (2002).
- Mestas, J., Ley, K. Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 18 (6), 228-232 (2008).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Rev Immunol. 14 (10), 986-995 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), e1546 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J Vis Exp. (94), e52174 (2014).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), e2848 (2011).
- Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II. Chemical Engineering Transactions. 38, 247-252 (2014).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
- Fain, J. N. Isolation of Free Brown and White Fat Cells. Diabetologia. 375 (1964), 555-561 (1968).
- Seglen, P. Preparation of isolated rat liver cells. Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Yu, S., Allen, J. N., et al. The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis. J Immunol. 197 (1), 256-265 (2016).
- Yu, Y. R. A., O’Koren, E. G., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS ONE. 11 (3), 1-23 (2016).
- Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires "M2c" polarization and MerTK induction. J Immunol. 100 (2), 130-134 (2012).
- Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages. PLoS ONE. 10 (12), 5-11 (2015).
- Rőszer, T. Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms. Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).
- Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages. Methods Enzymol. 4 (164), 297-314 (2011).
- Kim, Y. -. J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71 (1), 8-15 (2007).
- Tung, J. W., Heydari, K., et al. Modern Flow Cytometry: A Practical Approach. Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000. 6 (3), 13 (2014).
- Porcheray, F., Viaud, S., et al. Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation. Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).
- Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment. Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).
