בידוד, אפיון, טיהור של מקרופאגים רקמות מושפעות על ידי דלקת הקשורות להשמנת יתר
Summary
פרוטוקול זה מאפשר חוקר לבודד ולאפיין רקמות תושב מקרופאגים שונות הולמרק רקמות מודלק שחולצו מן הדיאטה-induced מודלים של הפרעות מטבוליות.
Abstract
השמנת יתר מקדמת מדינה דלקתית כרונית בעיקר מתווך על ידי רקמת תושב מקרופאגים, כמו גם נגזר מונוציט מקרופאגים. דיאטה-induced השמנת יתר (דיו) הוא מודל ערך לומד את התפקיד של הטרוגניות מקרופאג; עם זאת, ומשום מקרופאג נאותה קשים לרכוש רקמות מודלק. ב פרוטוקול זה, אנו מכינים את הצעדים בידוד ואת ההנחיות הדרושות לפתרון בעיות נגזר מן המחקרים שלנו להשגת אוכלוסייה מתאימים של מקרופאגים רקמות תושב של עכברים לאחר 18 שבועות עתירת שומן (HFD) או שומן/תיכון-כולסטרול ( התערבות תזונה HFHCD). פרוטוקול זה מתמקד שלוש רקמות הולמרק למד ב השמנת יתר, טרשת עורקים, כולל הכבד, רקמות adipose לבן (וואט) של העורקים. אנחנו להדגיש השימוש איך דואלית של זרימה cytometry ניתן להשיג מימד חדש של בידוד ואפיון של רקמות תושב מקרופאגים. מקטע יסוד של פרוטוקול זה מטפל המורכבות הבסיסית digestions אנזימטי רקמות ספציפיות מקרופאג בידוד, ואת הבאים נוגדן תא-פני מכתים לניתוח cytometric זרימה. פרוטוקול זה מטפל המורכבות הקיימת בבסיס תא לפעיל על-פלורסנט מיון (FACS) ומציגה הבהרות על המורכבות כדי להשיג אפיון במגוון רחב של אוכלוסיות תאים ממוינים כראוי. שיטות חלופיות העשרה הינם כלולים למיון תאים, כגון הכבד צפופה, ומאפשר גמישות וניהול זמן בעת עבודה עם FACS. בקצרה, פרוטוקול זה מסייע החוקר להעריך מקרופאג הטרוגניות של שפע של רקמות מודלק במחקר נתון, ומספק עצות לפתרון בעיות תובנה כי כבר מוצלח עבור בידוד תאית חיובית ואפיון של תאים חיסוניים בדלקת בתיווך דיו.
Introduction
העכבר מודלים היו בשימוש נרחב ללמוד את הדינמיקה של מחלות אנושיות. בידוד תקין של רקמות תאים תושב עכברים בתוך מדינה חולה יכול לספק פלטפורמה להבנת מולקולרית, תאית התרומות בפתוגנזה של המחלה1. הפרעה אחת זה חשיבות קריטית היא השמנת יתר. שכיחות ההשמנה ממשיכה לעלות בכל העולם במקביל לאינסולין סוג 2 סוכרת מחלות לב וכלי דם, מחלת כבד שומני2,3. צריכת מזון נוסף מוטה על ידי ירידה פעילות גופנית מפעילה שינו אותות שמקורם רקמת שומן, אשר יכול לשנות את חצרו הסלולר של רקמות היקפיים אחרים כגון אב העורקים ואת הכבד4. כזה שיבוש הומאוסטזיס המטבולית גורמת לדלקת מערכתית כרונית נמוך בכיתה5.
הפעלה קלאסית של מקרופאגים תושב העורקים ואת הכבד, כמו גם את הגיוס שומן לבן (וואט) הוכח ליזום dysregulation של אותות מטבולי אלא גם לקיים דלקת6,7. הטרוגניות פנוטיפי ופונקציונליים של מקרופאגים קשורה חזק בפתוגנזה של השמנת יתר הקשורים לעבודה morbidities7. הפלסטיות דינמי ב מקרופאג קיטוב מאפשר תאים אלה שהפגינו מגוון פנוטיפים מופעל זה לתאם את התקדמות והרזולוציה של דלקת8. בעוד בסגנון קלאסי מופעל מקרופאגים (M1) הם מעורבים על התפשטות של דלקת, לחלופין מופעל מקרופאגים (M2) קושרו עם רזולוציה ורקמות תיקון9,10.
כפי הגוף עובר מתח מטבולית, שומן לבן מצטבר באופן חריג. רקמת שומן המורחב מושך, שומר על תאים דלקתיים שמשנות עמוקות adipocyte רגילה פונקציה כדי לקדם את תנגודת לאינסולין, היפרגליקמיה, בסופו של דבר סוכרת סוג 2, תנגודת לאינסולין או היפרגליקמיה11, 12. במקביל, remodels שומן לבן בתגובה אותות דלקתיים שפורסמו על ידי הסתננו מופעל באופן קלאסי (M1) רקמת שומן מקרופאגים (כספומטים)13,14. איבר זה רב תאית מפעילה מפל של אותות זה תוקע את התיפקוד הרגיל של איברים אחרים בגוף כגון אבי העורקים, כבד4.
הכבד הוא עוצמתי מטבולית המסתגל בתגובה לגירויים שמקורם dysregulated הסמוך וואט15. מקרופאגים כבדית או תאים Kupffer, כתגובה לשינויים מטבוליים, מפרישים ציטוקינים דלקתיים שהופכים שניהם parenchymal ו תא הלא-parenchymal פנוטיפ ולקדם רקמות. הצטברות שומנים בדם הכבד, דלקת, פיקדונות מופרז מטריצה חוץ-תאית, נמק, הפונקציה בסופו של דבר אובדן כדלקמן העלבונות דלקתיות לתרום ספקטרום רחב של פגיעה בכבד הקשורים אלכוהוליים מחלת כבד שומני 1617,,18.
במקביל וואט פרוץ, תפקודי כבד, עורקים גדולים לצבור שומנים בתוך קיר עורקים כפי הגוף עובר מתח מטבולית כרונית19. הצטברות שומנים בדם עורקי מפעיל את הפרשת נוגדנים על ידי תאי אנדותל מופעל והגיוס עוקבות של monocytes20. ברגע גייס, ומונוציטים להתרבות, להבדיל, להבלע lipoproteins, להפוך לתאי קצף. Atherogenesis יזם, נגרם על ידי פעילות הפרו דלקתיים גייס ו רקמות לאדן השומנים תושב מקרופאגים. להיכנע האותות חוץ-תאית, תאיים סטרס נמסר ב- microenvironment atherogenic הזה, מקרופאגים האלה ואז לעסוק מוות איתות בהתאם להיררכית הקשרים. כאשר תאים אלה קצף מתים, הם תורמים את תוכנם השומנים מלא אל ליבה נמק של הנגע, מה שמוביל ואז קרע פלאק, אוטם שריר הלב ושבץ.
באופן קולקטיבי, הטרוגניות של פנוטיפים מקרופאג האחראית בחלקו השמנת יתר הנגרמת על ידי שינויים דלקתיים שנצפתה dysregulated רקמות כגון וואט, הכבד, אבי העורקים8,21. אפיון גייס, מקרופאגים תושב רקמות יכול לספק תובנות פוטנציאליים מטרות מולקולריות שמטפלות מקרופאג פנוטיפ1. לאפיין ביעילות מקרופאגים רקמות מודלק השמנת יתר-induced, ניתן לקבל השעיה תא בודד באמצעות עיכול אנזימטי. פרוטוקולים דיסוציאציה כזה חייב להיות יעיל דיו משפילים רקמת חיבור תוך מזעור מוות של תאים חיסוניים, מתן תשואה אופטימלית בתא. התערובת אנזים הוא תלוי בסוג הרקמה איפור המבני שלה. רקמות גמיש כמו אבי העורקים דורש פעילות אנזימטי חזק יותר, לעומת הכבד ו וואט, כדי להשיג רקמה דיסוציאציה. מן התליה תא בודד, מקרופאגים תושב רקמות ניתן חד משמעית מאופיין או מבודדים עבור נוסף במורד הזרם ניתוחים כגון יצירת פרופיל תעתיק.
כאן פרוטוקול רקמות ספציפיות מתואר המשתמשת תלויי-collagenase רקמות לעיכול, cytometry זרימה צבעוני לבודד ביעילות לאפיין את רקמת תושב מקרופאגים המתקבל השמנה דיאטה מסורתי המושרה, טרשת עורקים, פשוט steatosis ומודלים steatohepatitis העכבר. סימולטני מכתים של סמני פני שטח התא עם נוגדנים נגד ליקוציט-(CD45 או CD11b) וגם מקרופאג – אנטיגנים ספציפיים (F4/80) משמשת לעתים קרובות כדי לזהות אוכלוסיות מקרופאג22. תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) היא אסטרטגיה רב עוצמה המשמש למיון אוכלוסיות אלה שזוהו על טוהר גבוהה. אז ניתן להעריך האוכלוסייה ממוינים לפרופילי גנים ספציפיים פנוטיפ באמצעות אנליזה מולקולרית במורד הזרם (כגון תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת כמותית)23. למרות cytometry זרימה רגילה ומיון תא מבוססי cytometry זרימה כלים רבי-עוצמה בהבחנה מקרופאגים בתוך השעיה תא הטרוגנית מאוד, הפרוטוקולים לשעבר חייב להיות מוטבת כדי להבטיח פלט מוצלחת. במחקר זה, פרוטוקולים של ביעילות לבודד, לאפיין את רקמת קיימא מקרופאגים ספציפיים מתוארים; חשוב יותר, מחקר זה מספק תובנה מכריע בנושאים טכניים הנובעים לעתים קרובות, כמו גם אסטרטגיות פרואקטיבית וגישה לפתרון בעיות כדי למנוע ו/או לפתור אותן.
Protocol
Representative Results
Discussion
דיאטה-induced הפרעות מטבוליות בדגמי לחקות morbidities שיתוף כגון טרשת עורקים, steatosis פשוטה, steatohepatitis ואף סוכרת מסוג 2 נמצאים בשימוש נרחב כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס של התקדמות המחלה. עיכול תלויים collagenase משמש לעתים קרובות מביצועם רקמות לשחרר תאים16,מטריצה חוץ-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות על המתקן הליבה Cytometry זרימה ב- פנסילבניה המדינה אוניברסיטת המילניום מדע מורכבים.
Materials
| 26G x 5/8 in Needles | BD | 305115 | |
| 23G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set | BD | 367297 | Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion |
| 21G 1 1/2 in. Needles | BD | 305156 | |
| 1mL syringe with rubber stops | BD | 309659 | |
| 10mL Syringes | BD | 309604 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| F4/80 PE | Biolegend | 123110 | |
| CD11c PE/Cy7 | Biolegend | 117318 | |
| CD11b PE/Cy5 | eBioscience | 15-0112-81 | |
| Anti-mouse CD16/32 Fc Block | Biolegend | 101320 | |
| CD45 Pacific Blue | Biolegend | 103126 | |
| PE Rat IgG2a | Biolegend | 400508 | |
| PE/Cy7 Armenian Hamster IgG | Biolegend | 400922 | |
| PE/Cy5 Rat IgG2b | Biolegend | 400610 | |
| Pacific Blue Rat IgG2c | Biolegend | 400717 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 15-017-CV | |
| 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro | 21-031-CV | |
| 70 micron cell strainers | Corning, Inc. | 352350 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16X | Electron Microscopy Sciences | CAS #30525-89-4 | |
| Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23mm, Sharp | Stoelting | 52132-10P | Used for general dissecting purposes |
| Micro Forceps, 4in, full curve, 0.8mm | Stoelting | 52102-37P | Used for general dissecting purposes |
| Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge | Fine Science Tool | 15000-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
| Curved 0.07 x 0.04 mm Tip Forceps | Fine Science Tool | 11297-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
| Hemostatic Forceps (Curved) | Fine Science Tool | 13021-12 | |
| Heparin Sodium Salt | Fischer Scientific | 9041-08-1 | |
| 35mm Cell Culture/Petri Dishes | Fischer Scientific | 12-565-90 | |
| Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid | Fischer Scientific | 08-757-100D | |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-959-53A | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| 5mL Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fischer Scientific | 14-959-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) | Millipore | EX0285-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Rockland | BSA-50 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Collagenasse Type XI | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Hyaluronidase Type I | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| 500mL beaker | Sigma Aldrich | 02-540M | |
| 4 cm Hemostatic clamp | Stoelting | 52120-40 | |
| Toothed forceps | Stoelting | 52104-33P | |
| 50 micron Disposable filters | Systemex | 04-0042-2317 | |
| Collagenase Type IV | ThermoFischer Scientific | 17104019 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) | ThermoFischer Scientific | A1049201 | |
| Razors (0.22 mm (0.009")) | VWR International | 55411-050 | |
| Texas Red Live/Dead stain | Red viability stain (in Figure 1A) |
References
- Davies, L. C., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages: Then and Now. Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (12), 840-846 (2006).
- Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (12), 875-880 (2006).
- Jung, U., Choi, M. -. S. Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Int J Mol Sci. 15 (4), 6184-6223 (2014).
- Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome. Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).
- Vieira-Potter, V. J. Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues. Cell Microbiol. 16 (10), 1484-1492 (2014).
- Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 738-749 (2011).
- Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages. Front Immunol. 5 (1), 1-15 (2015).
- Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. Macrophages at the fork in the road to health or disease. Front Immunol. 6 (2), 1-6 (2015).
- Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5 (8), 1-22 (2014).
- Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (5), 367-377 (2008).
- Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (3), 262-277 (2014).
- Fujisaka, S., Usui, I., et al. Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice. Diabetes. 58 (9), 2574-2582 (2009).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).
- Qureshi, K., Abrams, G. A. Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 13 (26), 3540-3553 (2007).
- Bedossa, P., Paradis, V. Liver extracellular matrix in health and disease. J Pathol. 200 (4), 504-515 (2003).
- Tilg, H., Moschen, A. R. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis. Hepatology. 52 (5), 1836-1846 (2010).
- Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
- Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. Int J Obesity. 26 (12), 754-764 (2002).
- Mestas, J., Ley, K. Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 18 (6), 228-232 (2008).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Rev Immunol. 14 (10), 986-995 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), e1546 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J Vis Exp. (94), e52174 (2014).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), e2848 (2011).
- Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II. Chemical Engineering Transactions. 38, 247-252 (2014).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
- Fain, J. N. Isolation of Free Brown and White Fat Cells. Diabetologia. 375 (1964), 555-561 (1968).
- Seglen, P. Preparation of isolated rat liver cells. Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Yu, S., Allen, J. N., et al. The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis. J Immunol. 197 (1), 256-265 (2016).
- Yu, Y. R. A., O’Koren, E. G., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS ONE. 11 (3), 1-23 (2016).
- Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires "M2c" polarization and MerTK induction. J Immunol. 100 (2), 130-134 (2012).
- Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages. PLoS ONE. 10 (12), 5-11 (2015).
- Rőszer, T. Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms. Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).
- Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages. Methods Enzymol. 4 (164), 297-314 (2011).
- Kim, Y. -. J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71 (1), 8-15 (2007).
- Tung, J. W., Heydari, K., et al. Modern Flow Cytometry: A Practical Approach. Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000. 6 (3), 13 (2014).
- Porcheray, F., Viaud, S., et al. Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation. Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).
- Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment. Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).
