Summary

अलगाव, लक्षण वर्णन, और मोटापे से संबंधित सूजन से प्रभावित ऊतकों से मैक्रोफेज की शुद्धि

Published: April 03, 2017
doi:

Summary

इस प्रोटोकॉल की अनुमति देता है एक शोधकर्ता को अलग और ऊतक की विशेषता-विभिंन पहचान सूजन ऊतक आहार से निकाले में निवासी मैक्रोफेज चयापचय विकारों के मॉडल प्रेरित ।

Abstract

मोटापा एक पुरानी भड़काऊ राज्य है कि काफी हद तक ऊतक निवासी मैक्रोफेज द्वारा मध्यस्थता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से monocyte-मैक्रोफेज व्युत्पंन को बढ़ावा देता है । आहार-प्रेरित मोटापा (दिो) macrophage विविधता की भूमिका का अध्ययन करने में एक मूल्यवान मॉडल है; हालांकि, पर्याप्त macrophage अलगाव सूजन ऊतकों से प्राप्त करने के लिए मुश्किल हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम अलगाव कदम और आवश्यक समस्या निवारण दिशानिर्देश ऊतक के एक उपयुक्त जनसंख्या प्राप्त करने के लिए हमारे अध्ययन से प्राप्त करने के लिए रूपरेखा-निवासी मैक्रोफेज के 18 सप्ताह के बाद चूहों से उच्च वसा (HFD) या उच्च वसा/ HFHCD) आहार हस्तक्षेप. इस प्रोटोकॉल तीन बानगी जिगर, सफेद वसा ऊतकों (वाट), और महाधमनी सहित मोटापा और atherosclerosis में अध्ययन ऊतकों पर केंद्रित है । हम उजागर कैसे द्वैतवादी के उपयोग के प्रवाह cytometry अलगाव और ऊतक के लक्षण वर्णन-निवासी मैक्रोफेज के एक नए आयाम को प्राप्त कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल का एक मूलभूत खंड पते जटिलताओं अंतर्निहित ऊतक-विशिष्ट एंजाइमी पाचक और macrophage अलगाव, और बाद में सेल सतह एंटीबॉडी प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए धुंधला । इस प्रोटोकॉल के मौजूदा जटिलताओं के लिए फ्लोरोसेंट अंतर्निहित कक्ष छंटाई (FACS) और इन जटिलताओं को प्रस्तुत स्पष्टीकरण इतनी के रूप में पर्याप्त रूप से हल सेल आबादी से व्यापक रेंज लक्षण वर्णन प्राप्त करने के पते । वैकल्पिक संवर्धन तरीकों ऐसे घने जिगर के रूप में कोशिकाओं छंटाई, लचीलापन और समय प्रबंधन के लिए अनुमति जब FACS के साथ काम करने के लिए शामिल हैं । संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल शोधकर्ता एड्स एक दिया अध्ययन में सूजन ऊतकों की भीड़ से macrophage विविधता का मूल्यांकन करने और व्यावहारिक समस्या निवारण युक्तियां है कि अनुकूल सेलुलर अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए सफल रहा है प्रदान करता है की प्रतिरक्षा कोशिकाओं में दिो-मध्यस्थता सूजन ।

Introduction

माउस मॉडलों को बड़े पैमाने पर मानव रोगों की गतिशीलता का अध्ययन किया गया है । एक रोगग्रस्त राज्य में चूहों से ऊतक निवासी कोशिकाओं के समुचित अलगाव एक रोग के रोगजनन के लिए आणविक और सेलुलर योगदान को समझने के लिए एक मंच प्रदान कर सकते हैं1. एक विकार है कि महत्वपूर्ण महत्व का है मोटापा है । मोटापे की घटनाओं इंसुलिन प्रतिरोध और प्रकार 2 मधुमेह के साथ समानांतर में दुनिया भर में वृद्धि जारी है, हृदय रोग, और फैटी लीवर रोग2,3. अत्यधिक पोषक तत्वों की खपत आगे की कमी शारीरिक गतिविधि वसा ऊतक, जो महाधमनी और जिगर के रूप में अंय परिधीय ऊतकों के सेलुलर वातावरण बदल सकते है से निकलने को ट्रिगर बदलने के संकेत से विषम है4। एक पुरानी कम ग्रेड प्रणालीगत सूजन में चयापचय homeostasis परिणाम के इस तरह के विघटन5.

महाधमनी और जिगर के लिए मैक्रोफेज निवासी के शास्त्रीय सक्रियकरण के रूप में अच्छी तरह से सफेद वसा ऊतक (वाट) के लिए उनकी भर्ती के लिए न केवल चयापचय संकेतों की dysregulation आरंभ करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन यह भी सूजन को बनाए रखने6,7. मैक्रोफेज के phenotypic और कार्यात्मक विविधता मोटापे से संबंधित सह-रुग्णता के रोगजनन के साथ दृढ़ता से जुड़ा हुआ है7. macrophage ध्रुवीकरण में गतिशील प्लास्टिक के लिए इन कोशिकाओं को सक्रिय phenotypes की एक श्रृंखला है कि प्रगति और सूजन के समाधान के समंवय8के लिए अनुमति देता है । जबकि प्रतिष्ठित (M1) मैक्रोफेज सूजन के प्रचार में फंसा रहे हैं, वैकल्पिक रूप से सक्रिय (M2) मैक्रोफेज संकल्प और ऊतक की मरंमत के साथ संबद्ध किया गया है9,10

शरीर के रूप में चयापचय तनाव, सफेद वसा ऊतक असामान्य रूप से जमा हो जाती है । विस्तारित वसा ऊतक को आकर्षित करती है और भड़काऊ कोशिकाओं को बरकरार रखती है कि अंत में इंसुलिन प्रतिरोध को बढ़ावा देने के लिए सामान्य adipocyte समारोह में परिवर्तन, hyperglycemia और अंततः टाइप 2 मधुमेह, इंसुलिन प्रतिरोध या hyperglycemia11, 12. समानांतर में, सफेद वसा ऊतक घुसपैठ द्वारा जारी भड़काऊ संकेतों के जवाब में remodels क्लासिकल (M1) वसा ऊतक मैक्रोफेज (एटीएम)13,14। इस बहु-सेलुलर अंग संकेतों का झरना है कि इस तरह के महाधमनी और जिगर के रूप में शरीर के अंय अंगों के सामांय समारोह में उतारना4डालती है ।

जिगर एक चयापचय बिजलीघर है कि पास dysregulated वाट15से उद्भव उत्तेजनाओं के जवाब में अनुकूल है । यकृत मैक्रोफेज या Kupffer कोशिकाओं, चयापचय परिवर्तन के जवाब में, भड़काऊ साइटोकिंस कि दोनों parenchymal और गैर parenchymal सेल phenotype को बदलने और ऊतक remodeling को बढ़ावा देने के स्रावित । यकृत लिपिड संचय, सूजन, अत्यधिक extracellular मैट्रिक्स जमा, परिगलन और अंतिम समारोह हानि जिगर गैर शराबी फैटी लीवर रोग के साथ जुड़े नुकसान की व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए योगदान भड़काऊ अपमान के बाद 16,17,18.

समझौता वाट और जिगर समारोह के समानांतर में, बड़े धमनियों शरीर जीर्ण चयापचय तनाव19के रूप में धमनी की दीवार के भीतर लिपिड जमा । धमनी लिपिड संचय सक्रिय endothelial कोशिकाओं और monocytes20के बाद भर्ती द्वारा chemokines के स्राव से चलाता है । एक बार भर्ती, monocytes पैदा, अंतर, लिपो निगल और फोम कोशिकाओं बन जाते हैं । Atherogenesis और भर्ती और ऊतक निवासी लिपिड लादेन मैक्रोफेज के समर्थक भड़काऊ गतिविधि द्वारा शुरू की है । extracellular और intracellular तनाव इस atherogenic microenvironment में relayed संकेतों के सामने झुकने, इन मैक्रोफेज तो एक अपोप्तोटिक संकेतन झरना में संलग्न हैं । इन फोम कोशिकाओं के मरने के रूप में, वे घाव, जो फिर पट्टिका टूटना करने के लिए सुराग, रोधगलन, और स्ट्रोक की ओर जाता है उनके लिपिड भरा सामग्री योगदान ।

सामूहिक रूप से, भाग में macrophage phenotypes के विविधता इस तरह वाट, जिगर और महाधमनी8,21के रूप में dysregulated ऊतकों में मनाया भड़काऊ परिवर्तन द्वारा प्रेरित मोटापे का उद्घोष । भर्ती और ऊतक निवासी मैक्रोफेज के लक्षण वर्णन संभावित आणविक लक्ष्य है कि macrophage phenotype1हेरफेर में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है । प्रभावी रूप से मोटापे से प्रेरित सूजन ऊतकों से मैक्रोफेज की विशेषता के लिए, एक एकल कोशिका निलंबन एंजाइमी पाचन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है । इस तरह के पृथक्करण प्रोटोकॉल पर्याप्त अपमानजनक संयोजी ऊतक जबकि प्रतिरक्षा कोशिका मृत्यु को कम करने और इष्टतम सेल उपज प्रदान करने में प्रभावी होना चाहिए । एंजाइम मिश्रण ऊतक के प्रकार और उसके संरचनात्मक श्रृंगार पर निर्भर है । ऐसे महाधमनी के रूप में लचीला ऊतकों मजबूत एंजाइमी गतिविधि की आवश्यकता है, के रूप में जिगर और वाट की तुलना में, ऊतक पृथक्करण प्राप्त करने के लिए । एकल सेल निलंबन से, ऊतक निवासी मैक्रोफेज स्पष्ट रूप से विशेषता या transcriptional रूपरेखा के रूप में आगे बहाव के विश्लेषण के लिए अलग किया जा सकता है ।

यहाँ एक ऊतक-विशिष्ट प्रोटोकॉल का उपयोग करता है कि collagenase-निर्भर ऊतक पाचन और polychromatic प्रवाह cytometry को प्रभावी ढंग से अलग और ऊतक-निवासी मैक्रोफेज पारंपरिक आहार से प्राप्त मोटापे से प्रेरित की विशेषताएं, atherosclerosis, सिंपल steatosis और steatohepatitis माउस मॉडल्स । ल्युकोसैट के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ सेल सतह मार्करों के एक साथ धुंधला-(CD45 और/CD11b) और macrophage-(F4/विशिष्ट एंटीजन अक्सर macrophage आबादी22की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है । प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) उच्च शुद्धता पर इन की पहचान की आबादी को क्रमबद्ध करने के लिए इस्तेमाल एक शक्तिशाली रणनीति है. हल जनसंख्या तो phenotype विशिष्ट जीन बहाव आणविक विश्लेषण (जैसे मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया)23के रूप में) का उपयोग कर प्रोफाइल के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है । हालांकि मानक प्रवाह cytometry और प्रवाह cytometry-आधारित कक्ष छँटाई एक काफी विषम कोशिका निलंबन के भीतर मैक्रोफेज भेद में शक्तिशाली उपकरण हैं, पूर्व प्रोटोकॉल सफल उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. इस अध्ययन में, प्रोटोकॉल है कि प्रभावी ढंग से अलग और व्यवहार्य ऊतक विशिष्ट मैक्रोफेज विशेषताएं वर्णित हैं; इससे भी महत्वपूर्ण बात, इस अध्ययन तकनीकी मुद्दों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है कि अक्सर उठता है, साथ ही साथ सक्रिय और मुसीबत शूटिंग रणनीतियों को रोकने के लिए और/

Protocol

सभी प्रायोगिक प्रोटोकॉल (वर्गों 1, १.२, और १.३) पेंसिल्वेनिया राज्य विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया । ऊतक ?…

Representative Results

जब उपयोग apolipoprotein E आपुर्ति (ApoE KO) C57BL/6 (BL6) चूहों पर बनाए रखा एक उच्च वसा उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार (HCHFD या HCD) 18 सप्ताह के लिए, 1 x 104 -2 x 104 CD45+F4/80+ महाधमनी मैक्रोफेज जब दो नमूने है अलग किया जा सकता है ?…

Discussion

आहार प्रेरित चयापचय विकार मॉडल है कि atherosclerosis जैसे सह-रुग्णता नकल, सरल steatosis, steatohepatitis और प्रकार 2 मधुमेह बड़े पैमाने पर बेहतर रोग प्रगति के अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. Collagenase निर्भ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम पेंसिल्वेनिया राज्य विश्वविद्यालय मिलेनियम विज्ञान परिसर में प्रवाह Cytometry कोर सुविधा का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

26G x 5/8 in Needles BD 305115
23G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set BD 367297 Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21G 1 1/2 in. Needles BD 305156
1mL syringe with rubber stops BD 309659
10mL Syringes BD 309604
1mL Syringe BD 309659
F4/80 PE Biolegend 123110
CD11c PE/Cy7 Biolegend 117318
CD11b PE/Cy5 eBioscience 15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block  Biolegend 101320
CD45 Pacific Blue Biolegend 103126
PE Rat IgG2a Biolegend 400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG Biolegend 400922
PE/Cy5 Rat IgG2b Biolegend 400610
Pacific Blue Rat IgG2c Biolegend 400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)  Cellgro 15-017-CV
1X Phosphate Buffered Saline (PBS) Cellgro 21-031-CV
70 micron cell strainers Corning, Inc. 352350
 1.7 mL microcentrifuge tube  Denville C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16X Electron Microscopy Sciences CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23mm, Sharp  Stoelting 52132-10P Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4in, full curve, 0.8mm Stoelting 52102-37P  Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge  Fine Science Tool 15000-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 x 0.04 mm Tip Forceps  Fine Science Tool 11297-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved) Fine Science Tool 13021-12
Heparin Sodium Salt Fischer Scientific 9041-08-1
35mm Cell Culture/Petri Dishes Fischer Scientific 12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid Fischer Scientific 08-757-100D
15mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-959-53A
50mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-432-22
5mL Round-Bottom Polystyrene Tubes  Fischer Scientific 14-959-5
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) Millipore EX0285-1
Bovine Serum Albumin Rockland BSA-50
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6885
Collagenasse Type XI Sigma-Aldrich C7657
Hyaluronidase Type I Sigma-Aldrich H3506
DNAse Sigma-Aldrich DN25
Collagenase Type I Sigma-Aldrich C0130
NaOH Sigma Aldrich 1310-73-2 
CaCl2 Sigma Aldrich 449709-10G
500mL beaker  Sigma Aldrich 02-540M
4 cm Hemostatic clamp Stoelting 52120-40
Toothed forceps Stoelting 52104-33P
50 micron Disposable filters Systemex 04-0042-2317
Collagenase Type IV ThermoFischer Scientific 17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK) ThermoFischer Scientific  A1049201
Razors (0.22 mm (0.009")) VWR International 55411-050
Texas Red Live/Dead stain Red viability stain (in Figure 1A)

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Allen, J. N., Dey, A., Nissly, R., Fraser, J., Yu, S., Balandaram, G., Peters, J. M., Hankey-Giblin, P. A. Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation. J. Vis. Exp. (122), e55445, doi:10.3791/55445 (2017).

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