Isolement, caractérisation et Purification des Macrophages dans les tissus touchés par l’Inflammation associées à l’obésité

Résumé

Ce protocole permet un chercheur d’isoler et de caractériser les tissus-résident hallmark de macrophages dans divers tissus enflammés extraites de modèles induite par le régime alimentaire des troubles métaboliques.

Résumé

L’obésité favorise un état inflammatoire chronique qui est largement médiatisé par les macrophages tissulaires-résident ainsi que les macrophages dérivés de monocytes. L’obésité induite par l’alimentation (DIO) est un modèle précieux pour l’étude du rôle de l’hétérogénéité des macrophages ; Cependant, des isolations de macrophage adéquates sont difficiles à acquérir à partir de tissus enflammés. Dans ce protocole, nous décrivons les étapes de l’isolement et les directives de dépannage nécessaires provenant de nos études pour obtenir une population convenable des macrophages de tissu-résident de souris après 18 semaines de haute teneur en graisses (HFD) ou de la haute-graisse/riche en cholestérol ( Intervention HFHCD) de régime. Ce protocole se concentre sur trois tissus de hallmark étudiés dans l’obésité et l’athérosclérose y compris le foie, le tissu adipeux blanc (WAT) et l’aorte. Nous mettons en évidence l’utilisation comment dualiste de l’écoulement cytometry peut atteindre une nouvelle dimension de l’isolement et la caractérisation des macrophages de tissu-résident. Un article fondamental du présent protocole aborde les subtilités qui sous-tendent les digestions enzymatiques spécifiques des tissus et l’isolement de macrophage et ultérieures anticorps de surface cellulaire coloration pour cytométrie. Ce protocole traite des complexités existantes qui sous-tendent la cellule activée par fluorescence triant (FACS) et présente des éclaircissements à ces complexités afin d’obtenir la caractérisation de la vaste gamme de populations cellulaires correctement trié. Méthodes d’enrichissement de rechange sont inclus pour le tri des cellules, comme le foie dense, permettant la gestion de la flexibilité et l’heure lorsque vous travaillez avec des FACS. En bref, ce protocole facilite le chercheur pour évaluer l’hétérogénéité des macrophages d’une multitude de tissus enflammés dans une étude donnée et fournit des conseils de dépannage perspicaces qui ont réussi pour la caractérisation et l’isolement cellulaire favorable des cellules immunitaires dans l’inflammation induite par la DIO.

Introduction

Modèles de souris ont été largement utilisés pour étudier la dynamique des maladies humaines. Isolation correcte des cellules résidentes des souris dans un état de malade peut fournir une plate-forme pour comprendre les contributions moléculaires et cellulaires à la pathogenèse de la maladie¹. Un trouble qui est d’une importance cruciale est l’obésité. L’incidence de l’obésité continue d’augmenter dans le monde entier en parallèle avec la résistance à l’insuline et le type 2 mellitus de diabète, maladies cardiovasculaires et stéatose hépatique^2,3. Une consommation excessive en éléments ....

Protocole

Tous les protocoles expérimentaux (Sections 1, 1.2 et 1.3) ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à la Pennsylvania State University.

Tissu	Préparation de mémoires tampons de dissociation	Volume final	Stockage
Tissu adipeux blanc (WAT)	Tampon de dissociation : 2,5 % HEPES, 10 mg/mL, l’albumine sérique Bovine (BSA), 3 mg/mL (0,3 %) Collagénase de Type II dans de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) avec 4,5 g/L de glucose s....

Résultats

Lorsque vous utilisez la souris C57BL/6 (ApoE KO) (BL6) déficientes en apolipoprotéine E, soumis à une diète de haute graisse cholestérol élevé (HCHFD ou HCD) pendant 18 semaines, 1 x 10⁴ - 2 x 10⁴ CD45⁺⁺ de F4/80 macrophages aortiques peuvent être isolés, lorsque les deux échantillons sont mis en commun. Les foies disséqués des souris nourries HFHCD ApoE KO, produit plus de 5 x 10⁵ trier des cellules de Kupffer (qui dépend des temps .......

Discussion

Modèles de trouble métabolique induite par l’alimentation qui imitent des co-morbidités telles que l’athérosclérose, la stéatose simple, stéato-hépatite et diabète de type 2 sont largement utilisés pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents de la progression de la maladie. La charge digestion de collagénase est souvent utilisée pour dissocier les tissus pour libérer les cellules de la matrice extracellulaire (ECM)^16,27. Enzymes comme la collag.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Aiguilles de 26 g x 5/8 po BD		305115
23 g x aiguille de 0,75 po tube de 12 po Kit de prélèvement sanguin	BD	367297	Utilisé pour la canulation de la VCI sous-hépatique pendant la perfusion hépatique
21 G 1 1/2 po. Aiguilles	BD	305156
Seringue de 1 mL avec butées en caoutchouc	309659
	10 mL
F4/80 PE	Biolegend	123110
CD11c PE/Cy7	Biolegend	117318
CD11b PE/Cy5	eBioscience	15-0112-81
Anti-souris CD16/32 Fc Block  ;	Biolegend	101320
CD45 Bleu Pacifique	Biolegend	103126
PE Rat IgG2a	Biolegend	400508
PE/Cy7 Hamster arménien IgG Biolegend		400922
PE/Cy5 Rat IgG2b	Biolegend	400610
Rat bleu du Pacifique IgG2c	Biolegend	400717
Dulbecco' s Eagle Medium modifié (DMEM)  ;	Cellgro	15-017-CV
1x Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Cellgro	21-031-CV
70 &mu ; Crépines à cellules m	Corning, Inc.	352350
Tube de microcentrifugation de 1,7 mL	Denville	C2170
Solution aqueuse de paraformaldéhyde -16x	Microscopie électronique Sciences	CAS #30525-89-4
Micro ciseaux de dissection, 3,5 pouces, droit, 23 mm, pointu ;	Stoelting	52132-10P	Utilisé à des fins générales de dissection
Micro pince, 4 pouces, pleine courbure, 0,8 mm	Stoelting	52102-37P  ;	Utilisé à des fins générales de dissection
Ciseaux de dissection à ressort &ndash ; 3 mm Tranchant  ;	Outil de science fine	15000-10	Utilisé pour la dissection de l’aorte Étapes 1.3.3.17 à 1.3.3.28
Courbée 0,07 mm x 0,04 mm Pointe Pince	Outil de science fine	11297-10	Utilisé pour la dissection de l’aorte Étapes 1.3.3.17 à 1.3.3.28
Pince hémostatique (courbée)	Outil de science fine	13021-12
Héparine Sel de sodium	Fischer Scientific	9041-08-1
Boîtes de culture cellulaire/de Petri de 35 mm	Fischer Scientific	12-565-90
Boîtes de Pétri en polystyrène (10 cm) avec couvercle	Fischer Scientific	08-757-100D
Tubes à centrifuger coniques de 15 mL (polypropylène)	Fischer Scientific	14-959-53A
de 50 mL  ;( Polypropylène)	Fischer Scientific	14-432-22
5 mL Tubes en polystyrène à fond rond	Fischer Scientific	14-959-5
Sérum de veau fœtal	Gemini Bio-produits	100-106
Éthanol (alcool éthylique de base dénaturé, anyhydre)	Millipore	EX0285-1
Albumine sérique bovine	Rockland	BSA-50
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Collagénase de type II	Sigma-Aldrich	C6885
Collagénase Type XI	Sigma-Aldrich	C7657
Hyaluronidase Type I	Sigma-Aldrich	H3506
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25
Collagénase Type I	Sigma-Aldrich	C0130
NaOH	Sigma Aldrich	1310-73-2  ;
CaCl2	Sigma Aldrich	449709-10G
500 mL bécher  ;	Sigma Aldrich	02-540M
4 cm Pince hémostatique	Stoelting	52120-40
Pince dentée	Stoelting	52104-33P
50 &mu ; m Filtres jetables	Systemex	04-0042-2317
Collagénase Type IV	ThermoFischer Scientific	d’ammonium
de potassium (ACK)	ThermoFischer Scientific  ;		Rasoirs A1049201
(0,22 mm (0,009"))VWR	International	55411-050
Texas Red Live/Dead stain			Red viability stain (en Figure 1A)

seringues BD 309604 Seringue BD 309659 Tubes à centrifuger coniques 17104019 Chlorure