Cellular Redox Profiling mit hochauflösender Mikroskopie
Summary
Dieses Papier präsentiert einen hochauflösenden Mikroskopie-Workflow zur gleichzeitigen Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus sowie mitochondrialem Membranpotential und Morphologie – gemeinsam als mitochondriale Morphofunktion bezeichnet – in lebenden adhärenten Zellen unter Verwendung der zellpermeablen fluoreszierenden Reportermoleküle 5- (und- 6) -chlormethyl-2 ', 7'-dichlordihydrofluoresceindiacetat, Acetylester (CM-H 2 DCFDA) und Tetramethylrhodaminmethylester (TMRM).
Abstract
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) regulieren essentielle zelluläre Prozesse einschließlich Genexpression, Migration, Differenzierung und Proliferation. Allerdings induzieren übermäßige ROS-Spiegel einen Zustand von oxidativem Stress, der von irreversiblen oxidativen Schäden an DNA, Lipiden und Proteinen begleitet wird. Somit liefert die Quantifizierung von ROS einen direkten Proxy für den zellulären Gesundheitszustand. Da Mitochondrien zu den wichtigsten zellulären Quellen und Zielen von ROS gehören, ist die gemeinsame Analyse der mitochondrialen Funktion und der ROS-Produktion in denselben Zellen entscheidend für ein besseres Verständnis der Zusammenschaltung in pathophysiologischen Bedingungen. Daher wurde für die gleichzeitige Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus, mitochondrialem Membranpotential (ΔΨ m ) und mitochondrialer Morphologie eine hochgradige mikroskopiebasierte Strategie entwickelt. Es basiert auf automatisierte Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse von lebenden adhärenten Zellen, die in Multi-Well-Platten gewachsen sind, und staineD mit den zellpermeablen fluoreszierenden Reportermolekülen CM-H 2 DCFDA (ROS) und TMRM (ΔΨ m und mitochondrialer Morphologie). Im Gegensatz zur Fluorimetrie oder Durchflusszytometrie erlaubt diese Strategie die Quantifizierung von subzellulären Parametern auf der Ebene der einzelnen Zelle mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung, sowohl vor als auch nach der experimentellen Stimulation. Wichtig ist, dass die bildbasierte Natur des Verfahrens die Extraktion von morphologischen Parametern zusätzlich zu den Signalintensitäten ermöglicht. Der kombinierte Feature-Set wird für die explorative und statistische multivariate Datenanalyse verwendet, um Unterschiede zwischen Subpopulationen, Zelltypen und / oder Behandlungen zu erkennen. Hier wird eine detaillierte Beschreibung des Assays gegeben, zusammen mit einem Beispielversuch, das sein Potenzial für eine eindeutige Diskriminierung zwischen zellulären Zuständen nach chemischer Störung beweist.
Introduction
Die Konzentration des intrazellulären ROS wird durch ein dynamisches Zusammenspiel zwischen ROS-produzierenden und ROS-Entschärfungssystemen akribisch reguliert. Ungleichgewicht zwischen den beiden provoziert einen Zustand des oxidativen Stresses. Unter den Hauptquellen der ROS sind Mitochondrien 1 . Angesichts ihrer Rolle bei der Zellatmung sind sie verantwortlich für den Großteil der intrazellulären Superoxid (O 2 • – ) – Moleküle 2 . Dies ergibt sich meist aus Elektronenleckage zu O 2 am Komplex 1 der Elektronentransportkette unter Bedingungen eines starken negativen inneren mitochondrialen Membranpotentials (Δψ m ), dh mitochondrialer Hyperpolarisation. Auf der anderen Seite wurde auch die mitochondriale Depolarisation mit einer erhöhten ROS-Produktion korreliert, die auf mehrere Wirkmechanismen 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 Darüber hinaus wird durch Redox-Modifikationen in Proteinen der Spalt-Fusions-Maschinerie ROS die mitochondriale Morphologie 9 regulieren. Beispielsweise ist die Fragmentierung mit einer erhöhten ROS-Produktion und Apoptose 10 , 11 korreliert, während filamentöse Mitochondrien mit Nährstoffverhungern und Schutz verbunden sind Mitophagie 12 Angesichts der komplizierten Beziehung zwischen zellulärem ROS und mitochondrialer Morphofunktion sollten beide idealerweise gleichzeitig in lebenden Zellen quantifiziert werden. Um dies genau zu tun, wurde ein hochauflösender Bildgebungsassay auf der Grundlage einer automatisierten Breitfeldmikroskopie und einer Bildanalyse von adhärenten Zellkulturen entwickelt, die mit den Fluoreszenzsonden CM-H 2 DCFDA (ROS) und TMRM (mitochondrialem Δψ m und Morphologie) gefärbt wurden. High-Content-Imaging bezieht sich auf die Extraktion von spAtiotemporell reiche ( dh große Anzahl von beschreibenden Merkmalen) Informationen über zelluläre Phänotypen mit mehreren komplementären Markern und automatisierten Bildanalysen. In Kombination mit automatisierter Mikroskopie können viele Proben parallel ( dh Hochdurchsatz) abgeschirmt werden, wodurch die statistische Kraft des Assays erhöht wird. In der Tat ist ein Hauptbestandteil des Protokolls, dass es die gleichzeitige Quantifizierung von mehreren Parametern in der gleichen Zelle ermöglicht, und dies für eine große Anzahl von Zellen und Bedingungen.
Das Protokoll wird in 8 Teile aufgeteilt (im Detail beschrieben im Protokoll): 1) Seeding-Zellen in einer 96-Well-Platte; 2) Vorbereitung von Stammlösungen, Arbeitslösungen und Bildgebungspuffer; 3) Aufstellung des Mikroskops; 4) Beladen der Zellen mit CM-H 2 DCFDA und TMRM; 5) Erste Live-Imaging-Runde zur Messung der basalen ROS-Werte und der mitochondrialen Morphofunktion; 6) Zweite Live-Bildgebung nach Zugabe von tert. -ButylPeroxid (TBHP) zur Messung induzierter ROS-Werte; 7) Automatisierte Bildanalyse; 8) Datenanalyse, Qualitätskontrolle und Visualisierung.
Der Assay wurde ursprünglich für normale menschliche dermale Fibroblasten (NHDF) entwickelt. Da diese Zellen groß und flach sind, eignen sie sich gut zur Beurteilung der mitochondrialen Morphologie in 2D-Weitfeldbildern 13 , 14 . Bei kleineren Modifikationen ist diese Methode jedoch auf andere adhärente Zelltypen anwendbar. Darüber hinaus entspricht neben der Kombination von CM-H 2 DCFDA und TMRM der Workflow einer Vielzahl von fluoreszierenden Farbstoffpaaren mit unterschiedlichen molekularen Spezifitäten 1 , 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Papier beschreibt eine hochauflösende Mikroskopie-Methode zur gleichzeitigen Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus und mitochondrialer Morphofunktion in NHDF. Seine Leistung wurde mit einer Fallstudie über SQV-behandelten NHDF nachgewiesen. Die Ergebnisse unterstützen frühere Hinweise aus der Literatur, bei denen nach der Behandlung mit HIV-Protease-Inhibitoren des Typs 1 erhöhte ROS-Spiegel oder mitochondriale Dysfunktion beobachtet wurden, wenn auch in separaten Experimenten 19…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.
Materials
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 ml | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1M 500mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20x objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
References
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