Cellulär redoxprofilering med hög innehållsmikroskopi
Summary
Detta papper presenterar ett högt innehållsmikroskopi-arbetsflöde för samtidig kvantifiering av intracellulära ROS-nivåer, såväl som mitokondriell membranpotential och morfologi – gemensamt betecknad som mitokondriell morfofunktion – i levande vidhäftande celler med användning av cell-permeant fluorescerande reportermolekyler 5- (och- 6) -klorometyl-2 ', 7'-diklorodihydrofluoresceindiacetat, acetylester (CM-H2 DCFDA) och tetrametylrhodamin-metylester (TMRM).
Abstract
Reaktiva syrearter (ROS) reglerar väsentliga cellulära processer inklusive genuttryck, migration, differentiering och proliferation. Överdrivna ROS-nivåer inducerar emellertid ett tillstånd av oxidativ stress, som åtföljs av irreversibel oxidativ skada på DNA, lipider och proteiner. Således ger kvantifiering av ROS en direkt proxy för cellulärt hälsotillstånd. Eftersom mitokondrier är bland de huvudsakliga cellulära källorna och målen för ROS är gemensam analys av mitokondriell funktion och ROS-produktion i samma celler avgörande för att bättre förstå sammankopplingen i patofysiologiska förhållanden. Därför utvecklades en mikroskopibaserad strategi med hög innehåll för samtidig kvantifiering av intracellulära ROS-nivåer, mitokondriellmembranpotential (ΔΨ m ) och mitokondriell morfologi. Den är baserad på automatiserad widefield fluorescensmikroskopi och bildanalys av levande vidhäftande celler, odlade i flera brunnsplattor och staineD med de cellgenomsläppliga fluorescerande reportermolekylerna CM-H2 DCFDA (ROS) och TMRM (A ^ m och mitokondriellmorfologi). I motsats till fluorimetri eller flödescytometri möjliggör denna strategi kvantifiering av subcellulära parametrar vid nivån hos den individuella cellen med hög spatiotemporal upplösning, både före och efter experimentell stimulering. Viktigt är att den bildbaserade naturen av metoden möjliggör extraktion av morfologiska parametrar utöver signalintensiteter. Den kombinerade funktionssatsen används för explorativ och statistisk multivariabel dataanalys för att detektera skillnader mellan subpopulationer, celltyper och / eller behandlingar. Här tillhandahålls en detaljerad beskrivning av analysen tillsammans med ett exempelxperiment som visar sin potential för entydig diskriminering mellan cellulära tillstånd efter kemisk störning.
Introduction
Koncentrationen av intracellulär ROS regleras noggrant genom ett dynamiskt samspel mellan ROS-producerande och ROS-defusionssystem. Ojämlikhet mellan de två provocerar ett tillstånd av oxidativ stress. Bland de viktigaste källorna till ROS är mitokondrier 1 . Med tanke på deras roll i cellulär andning är de ansvariga för huvuddelen av intracellulära superoxid (O 2 • – ) molekyler 2 . Detta resulterar främst från elektronläckage till O2 vid komplex 1 av elektrontransportkedjan under förhållanden med stark negativ inre mitokondriell membranpotential (ψψm), dvs mitokondriell hyperpolarisation. Å andra sidan har mitokondriell depolarisering också korrelerats med ökad ROS-produktion som pekar på flera sätt av åtgärd 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . Vidare samverkar ROS genom redoxmodifieringar i proteiner i fission-fusionsmaskineriet med mitokondriell morfologi 9. Exempelvis är fragmentering korrelerad med ökad ROS-produktion och apoptos 10 , 11 medan filamentösa mitokondrier har kopplats till näringshämning och skydd mot Mitofagi 12 . Med tanke på det invecklade förhållandet mellan cellulär ROS och mitokondriell morfofunktion, borde båda idealt kvantifieras samtidigt i levande celler. För att göra exakt detta utvecklades en höghaltig bildningsanalys baserad på automatiserad widefieldmikroskopi och bildanalys av vidhäftande cellkulturer färgade med fluorescerande sonder CM-H 2 DCFDA (ROS) och TMRM (mitokondriell ψψ m och morfologi). Högbildningsavbildning avser extraktion av spAtiotemporalt rik ( dvs stort antal beskrivande egenskaper) information om cellulära fenotyper med multipla komplementära markörer och automatiserade bildanalyser. När de kombineras med automatiserad mikroskopi kan många prover siktas parallellt ( dvs. hög genomströmning), vilket ökar analysens statistiska kraft. En viktig egenskap i protokollet är faktiskt att det möjliggör simultan kvantifiering av flera parametrar i samma cell, och detta för ett stort antal celler och villkor.
Protokollet är uppdelat i 8 delar (beskrivs i detalj i protokollet nedan): 1) Fröskivor i en 96-brunnsplatta; 2) Framställning av stamlösningar, arbetslösningar och bildningsbuffert; 3) Inställning av mikroskopet; 4) Laddning av cellerna med CM-H2 DCFDA och TMRM; 5) Första levande bildrundan för att mäta basala ROS-nivåer och mitokondriell morfofunktion; 6) Andra levande bildningsrunda efter tillsats av tert -butylPeroxid (TBHP) för att mäta inducerade ROS-nivåer; 7) Automatiserad bildanalys; 8) Dataanalys, kvalitetskontroll och visualisering.
Analysen utvecklades ursprungligen för normala humana dermala fibroblaster (NHDF). Eftersom dessa celler är stora och plana, är de väl lämpade för bedömning av mitokondriell morfologi i 2D widefieldbilder 13 , 14 . Med mindre ändringar är denna metod dock tillämplig på andra vidhäftande celltyper. Vidare uppfyller arbetsflödet bredvid kombinationen av CM-H 2 DCFDA och TMRM ett flertal fluorescerande färgpar med olika molekylspecifikationer 1 , 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta dokument beskrivs en mikroskopi med hög innehåll för samtidig kvantifiering av intracellulära ROS-nivåer och mitokondriell morfofunktion i NHDF. Dess prestanda demonstrerades med en fallstudie på SQV-behandlad NHDF. Resultaten stöder tidigare bevis från litteraturen där ökad ROS-nivå eller mitokondriell dysfunktion har observerats efter behandling med HIV-proteashämmare av typ 1, om än i separata experiment 19 , 20 , <sup class="x…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.
Materials
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 ml | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1M 500mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20x objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
References
- Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
- Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, 1-17 (2012).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
- Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
- Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
- Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
- Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
- Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology?. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics–mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
- Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
- Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
- Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
- Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , 474-485 (1994).
- Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. . shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , (2017).
- Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
- Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
- Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
- Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
- Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
- Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
- Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor–saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
- Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
- Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035 (2015).
- . Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006)
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
- Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
- Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O’Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
- Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
- Fercher, A., O’Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
- Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
- Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
- Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).
