यहां, हम आरएनए नमूनों में जीनोमिक डीएनए (gDNA) संदूषण के बारे में पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । प्रस्तुत विधि राइबोसोमल डीएनए (rDNA) जीन के आंतरिक लिखित स्पेसर क्षेत्र (इसके) के लिए विशिष्ट प्राइमरों का इस्तेमाल करता है । विधि सबसे eukaryotes और prokaryotes में डीएनए संदूषण का विश्वसनीय और संवेदनशील पता लगाने के लिए अनुकूल है ।
एक विधि बड़े पैमाने पर जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन और प्रतिलिपि बहुतायत के ठहराव के लिए इस्तेमाल किया रिवर्स-प्रतिलेखन मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (RT-qPCR) है । यह सटीक, संवेदनशील, विश्वसनीय और प्रतिलिपि परिणाम प्रदान करता है । कई कारकों की संवेदनशीलता और RT-qPCR की विशिष्टता को प्रभावित कर सकते हैं । अवशिष्ट जीनोमिक डीएनए (gDNA) संदूषण आरएनए नमूने उनमें से एक है । जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में, गैर विशिष्ट gDNA संदूषण के कारण प्रवर्धन प्रतिलिपि स्तर की बहुतायत का अनुमान लगाना होगा और RT-qPCR परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं । आम तौर पर, gDNA qRT-पीसीआर intergenic क्षेत्रों या ब्याज की जीन के एक intron के लिए एनीलिंग प्राइमर जोड़े का उपयोग करके पता चला है । दुर्भाग्य से, intron/एक्सॉन एनोटेशन अभी तक हड्डीवाला, बैक्टीरिया, protist, कवक, संयंत्र, और invertebrate metazoan प्रजातियों से सभी जीनों के लिए नहीं जाना जाता है ।
यहां हम राइबोसोमल डीएनए (rDNA) आधारित प्राइमरों का उपयोग करके आरएनए नमूनों में gDNA संदूषण का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । विधि rDNA की अनूठी विशेषताओं पर आधारित है: उनके multigene प्रकृति, अत्यधिक संरक्षित दृश्यों, और जीनोम में उच्च आवृत्ति । इसके अलावा एक मामले के अध्ययन के रूप में, प्राइमरों का एक अनूठा सेट Poaceae परिवार में राइबोसोमल डीएनए (rDNA) के संरक्षण क्षेत्र के आधार पर डिजाइन किए गए थे । इन प्राइमरी जोड़े की सार्वभौमिकता पिघल वक्र विश्लेषण और agarose जेल ट्रो द्वारा परीक्षण किया गया था । हालांकि हमारे विधि बताते है कैसे rDNA आधारित प्राइमरों Poaceae परिवार में gDNA संदूषण परख के लिए लागू किया जा सकता है, यह आसानी से अंय prokaryote और यूकेरियोट प्रजातियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है
दिलचस्प जीन सेट या सिग्नलिंग नेटवर्क के transcriptional विनियमन की खोज के लिए जटिल आणविक जैविक घटनाओं में शामिल तंत्र को समझने के लिए आवश्यक है1. वर्तमान में, qPCR विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति अध्ययन है कि या तो डीएनए (जीनोम) या आरएनए (transcriptome) जो अनुमति methylome और transcriptome विश्लेषण, क्रमशः लक्ष्य कर सकते है के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण है । रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) qPCR द्वारा पीछा व्यापक रूप से transcriptome विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है कि उपाय जैविक अनुसंधान के विभिंन क्षेत्रों में जीन अभिव्यक्ति का स्तर2। पारंपरिक उत्तरी संकरण के रूप में अन्य तरीकों की तुलना में, सीटू संकरण, ribonuclease संरक्षण परख (RPA), और अर्द्ध आरटी पीसीआर, सटीकता, सुविधा, गति, और व्यापक गतिशील रेंज के माध्यम से ऊतक विशिष्ट डिटेक्शन qPCR आधारित परख अत्यधिक उल्लेखनीय है3,4। वहां कई महत्वपूर्ण कारकों है कि दूत आरएनए (mRNA) के एक विश्वसनीय ठहराव के लिए विचार किया जाना है, की गुणवत्ता और आरएनए शुरू सामग्री की मात्रा भी शामिल है । इसके अलावा, गैर विशिष्ट प्रवर्धन, आरटी की दक्षता-qPCR, और पीसीआर दक्षता के लिए5,6पर विचार किया जाना है ।
gDNA की उपस्थिति के कारण आरएनए निष्कर्षण के दौरान एक अंतर्निहित समस्या है, भाग में, डीएनए और आरएनए7के समान भौतिक और रासायनिक गुणों के लिए. gDNA और पूरक डीएनए (सीडीएनए) mRNA नमूनों से व्युत्पंन की अनुक्रम पहचान के कारण, गैर विशिष्ट प्रवर्धन हो सकता है, जो RT-qPCR परिणामों की सटीकता को प्रभावित करेगा । शेष gDNA जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में लक्ष्य mRNA की बहुतायत का अधिक से अधिक आकलन करने के लिए नेतृत्व करेंगे8।
मूलतः, गैर विशिष्ट amplicon ज्यादातर प्राइमर से उठता है-डिमर गठन या विशिष्ट पृष्ठभूमि gDNA के कारण प्रवर्धन, दोनों जिनमें से उचित नियंत्रण नमूनों का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है । इस तरह के नमूनों कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) और कोई रिवर्स transcriptase नियंत्रण (NRT), क्रमशः कर रहे हैं । नमूनों में gDNA संदूषण के स्तर के बाद से अध्ययन किया जा रहा अलग है और gDNA की ओर संवेदनशीलता विश्लेषण के बीच बहुत भिंन है जीन, NRT नियंत्रण प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक/ हालांकि यह काफी लागत और RT-qPCR अध्ययन में श्रम बढ़ जाती है, इन नियंत्रणों को7,9आवश्यक हैं ।
वैकल्पिक gDNA संदूषण से निपटने के तरीकों intergenic क्षेत्रों या ब्याज की जीन के एक intron के लिए प्राइमर जोड़े एनीलिंग के उपयोग में शामिल10, और प्राइमरों के उपयोग कि या तो एक बड़ी intron पार्श्व या एक एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शन, यानी अवधि एनीलिंग साइटें परिपक्व mRNA अनुक्रम1,4में अनुपस्थित हैं । हालांकि, intron/एक्सॉन एनोटेशन कई हड्डीवाला, बैक्टीरिया, protist, कवक, संयंत्र, और invertebrate metazoan प्रजातियों में से सभी जीनों के लिए अभी तक जाना जाता है । इसके अतिरिक्त कई युकेरियोटिक जीवों को दोहराव की घटनाओं से pseudogenes प्राप्त होती है । इसके अलावा, introns भर में प्राइमर डिजाइन गैर gDNA के प्रवर्धन की गारंटी नहीं है । DNase के लिए जीनोमिक क्षेत्रों के क्रोमेटिन पहुंच के रूप में मैं बदलता है, यह अलग से विभिंन गुणसूत्रों को लक्षित जोड़े10डिजाइन की सिफारिश की है ।
युकेरियोटिक जीवों के जीनोम ribosomes गठन के लिए आवश्यक राइबोसोमल उपइकाईयों एंकोडिंग rDNA जीन की एक हजार प्रतियां तक शामिल कर सकते हैं । इन rDNA जीन अक्सर एकल या मिलकर दोहराने arrays11में आयोजित कर रहे हैं । Polycistronic rRNAs (चित्रा 1) सहित बड़ी उपइकाई (LSU) और छोटे उपइकाई (SSU) आरएनए पोलीमरेज़ मैं (आरएनए पोल मैं) द्वारा लिखित हैं । परिणामस्वरूप पूर्व rRNAs आगे दो आंतरिक लिखित स्पेसर क्षेत्रों ITS1 और ITS2 को नष्ट करने के द्वारा संसाधित कर रहे हैं । अंतिम उत्पादों के रूप में, तीन परिपक्व rRNAs, 17-18S rRNA (SSU), 5.8 एस, और 25-28S rRNA (LSU)12उत्पंन कर रहे हैं । rDNA जीन अत्यधिक संरक्षित दृश्यों के साथ एक multigene परिवार के विशिष्ट प्रतिनिधि हैं । वे जीनोम में एक उच्च आवृत्ति के साथ होते है और संभावित रूप से एक से अधिक गुणसूत्र स्थान13पर मौजूद हैं । rRNA के प्रसंस्करण और प्रतिलिखित स्पेसर्स के क्षरण nucleolus में एक तेजी से प्रक्रिया है । दोहराव के उच्च डिग्री के कारण, कम कॉपी intron दृश्यों और ब्याह के अग्रदूतों की तुलना में जीनोमिक कॉपी संख्या और डिटेक्टिव अनप्रोसेस्ड आरएनए के अणुओं का अनुपात कम होता है । इन सुविधाओं rDNA जीन अच्छी तरह से सबसे eukaryotes और prokaryotes3में gDNA संदूषण के विश्वसनीय और अति संवेदनशील का पता लगाने के लिए अनुकूल बनाने के लिए ।
यहाँ आरएनए नमूनों में gDNA संदूषण का पता लगाने के लिए एक उपन्यास प्रक्रिया बताई गई है. rDNA संरक्षित अनुक्रम के आधार पर यूनिवर्सल प्राइमरों का एक सेट कई Poaceae प्रजातियों में gDNA परख के लिए प्रस्तुत किया है । विशिष्टता और प्रस्तावित प्राइमरों की सार्वभौमिकता पिघल वक्र विश्लेषण द्वारा परीक्षण किया गया एक टेंपलेट के रूप में डीएनए का उपयोग कर । हमारे प्रोटोकॉल केवल Poaceae के लिए लागू नहीं है, लेकिन यह भी आसानी से अंय युकेरियोटिक और prokaryotic प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
मात्रात्मक द्वारा जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण पीसीआर हाल के वर्षों में व्यापक रूप से लागू किया गया है । इस तेजी से, लागत प्रभावी, और स्वचालित विधि का मुख्य लाभ इसका सटीक और सटीक परिणाम है । हालांकि, इन फायदों से इष्टतम लाभ प्राप्त करने qPCR प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया मापदंडों के सेटअप की स्पष्ट समझ की आवश्यकता है । qPCR जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में एक विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, यह आरएनए नमूना3,15में प्राइमरी-डिमर या gDNA संदूषण से उत्पन्न होने वाले विशिष्ट प्रवर्धन से बचने के लिए आवश्यक है. यह आशा की जाती है कि आरएनए प्रतिलिपि स्तरों को gDNA प्रदूषित8के तहत आंका जाएगा । यहां, एक rDNA जीन की अनूठी विशेषताओं आरएनए नमूनों में एक gDNA संदूषण परख के लिए माना जाता था ।
इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए rDNA के मूल गुण: राइबोसोमल जीन दो चरमपंथ, अर्थात् ITS1 और ITS2, और तीन rRNA एंकोडिंग जीन, 17-18S, 5.8 एस, और 25-28S उपइकाई12से मिलकर बनता है । दो अपने क्षेत्रों राइबोसोमल उपइकाइयों के कोडिंग अनुक्रम का हिस्सा नहीं हैं । एक endonuclease, helicase, और exonuclease गतिविधि: वे कम से कम तीन एंजाइमी गतिविधियों से हटा रहे है करने के लिए अग्रदूत साबित परिपक्व rRNA के लिए प्रक्रिया । के रूप में राइबोसोमल आरएनए एक polycistronic प्रतिलिपि के रूप में लिखित है, एक प्राथमिक चरमपंथ युक्त उत्पाद निश्चित रूप से मौजूद है । प्रसंस्करण बहुत तेजी से होता है और nucleolus में जगह लेता है, और qPCR विधि का पता लगाने की सीमा के नीचे है कि इसकी पहचान करने वाले अग्रदूत साबित अणुओं की मात्रा । इसलिए, जब ITS1 या ITS2 अपनी पार्श्व प्राइमरों से परिलक्षित कर रहे हैं, कोई प्रवर्धन आरएनए नमूनों में पता लगाया जा सकता है जब तक gDNA संदूषण मौजूद नहीं है । युकेरियोटिक जीवों के जीनोम में rDNA जीन की संख्या को एक हजार प्रतियों तक शामिल करने का अनुमान था, जो गुणसूत्रों पर एकल या मिलकर सरणियों की व्यवस्था कर रहे हैं11. इस प्रोटोकॉल में, हम एक वैकल्पिक रास्ते का प्रस्ताव, NRT के बजाय, gDNA संदूषण का पता लगाने के लिए, जो प्रत्येक प्रतिक्रिया में प्रयोग किया जाता है/
मौजूदा पद्धतियों के संबंध में लाभ और सीमाएं: NRT आम तौर पर तैयार आरएनए नमूना साफ है या gDNA द्वारा दूषित है कि क्या परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. चूंकि gDNA प्रदूषित अलग आरएनए नमूनों के बीच समान रूप से वितरित नहीं किया जाता है, और gDNA के प्रति प्रतिक्रिया संवेदनशीलता काफी विश्लेषण जीन द्वारा प्रभावित है, NRT नियंत्रण प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक हैं/ यह काफी लागत और परिश्रम जब कई नमूनों को एक साथ3,9हैंडलिंग जोड़ देगा । अंय वैकल्पिक साहित्य में प्रलेखित तरीकों gDNA का पता लगाने के लिए intron विशिष्ट प्राइमरों के उपयोग, या डिजाइनिंग प्राइमरों कि या तो एक intron पार्श्व या एक एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शन अवधि शामिल हैं । इन तरीकों की सीमाएं intron अनुक्रम जानकारी की अनुपलब्धता से स्टेम, intron/एक्सॉन संरचना की अपूर्ण एनोटेशन, और जीन या ब्याज की pseudogenes में introns के अभाव में1,4,10 . विकास के कारण, rDNA जीन multigene और उच्च संरक्षित जीन परिवारों के रूप में मौजूद हैं । वे जीनोम में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में और विभिंन गुणसूत्रों पर मौजूद है13। अंय कोडिंग या nonconding जीन की तुलना में, rDNA जीन gDNA संदूषण का पता लगाने के लिए सबसे अच्छा फिट दिखाते हैं । तुलनात्मक transcriptomic विश्लेषणों में, rRNA औजार द्वारा qPCR डेटा का सामान्यीकरण कुछ मुद्दों के लिए अनुशंसित नहीं है, जैसे सीडीएनए तैयारी में अंतर (polyA भड़काना बनाम यादृच्छिक hexamer भड़काना), rRNA और mRNA के बीच बहुतायत में बड़े अंतर , और जो भ्रामक परिणाम10,16उत्पंन कर सकते है विभिंन उत्पत्ति । हालांकि, हम सिर्फ समस्याओं का उल्लेख किया है gDNA संदूषण परख के लिए एक लाभ कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, जीनोम में उच्च लक्ष्यीकरण साइट बहुतायत के संबंध में, और विभिन्न गुणसूत्रों पर स्थानीयकरण, rDNA आधारित प्राइमरों काफी मौजूदा तरीकों की तुलना में gDNA का पता लगाने संवेदनशीलता में सुधार.
rDNA के Versality-दूसरे जीव के आधार पर: rDNA जीन एक अच्छी तरह से अध्ययन जीन परिवार ज्यादातर जीवों में पहचान कर रहे हैं । प्रस्तावित rDNA-आधारित विधि gDNA संदूषण परख के लिए एक सरल, अति संवेदनशील, और आर्थिक प्रणाली का प्रतिनिधित्व करती है जो अंय युकेरियोटिक और prokaryotic जीवों (प्रोटोकॉल 2-5) के लिए आसानी से अनुकूलित हो सकती है । एक मामले का अध्ययन के रूप में, हम यहां कुछ Poceae प्रजातियों में इस पद्धति की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है (चित्रा 4 और चित्रा 5) । प्रयुक्त प्राइमरों अंय Poceae प्रजातियों में rDNA उपइकाईयों के अत्यधिक संरक्षित संरचना के कारण प्रजातियों के लिए स्थानांतरण की एक उच्च दर दिखाते हैं । यह समस्या और भी महत्वपूर्ण हो जाता है जब पर्याप्त जीनोमिक अनुक्रम जानकारी प्राइमर डिजाइन के लिए उपलब्ध नहीं है । इस प्रकार, एक प्रजातियों के लिए डिजाइन अपनी पार्श्व प्राइमर एक संबंधित प्रजातियों में इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, 5.8 s-F/आर प्राइमरों एक संरक्षित आकृति है कि सबसे फूल पौधों में उच्च समानता से पता चलता है के आधार पर उठाया गया14। हालांकि उच्च प्रवाह अनुक्रमण तकनीक स्थाई रूप से ज्ञात जीनोम की संख्या में वृद्धि, अधिकांश जीवों की एक्सॉन-intron एनोटेशन पूरा नहीं है, और इसलिए यह अक्सर एक एक्सॉन-एक्सॉन सीमा अवधि के लिए प्राइमरों डिजाइन करने के लिए संभव नहीं है । हमारे विधि बताते है कैसे rDNA आधारित प्राइमरों prokaryotes और eukaryotes के qPCR विश्लेषण में एक परख/प्राइमरी संयोजन में महंगी NRT नियंत्रण को नष्ट करने के लक्ष्य के साथ gDNA संदूषण परख के लिए लागू किया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को जेनेटिक एंड एग्रीकल्चरल बायोटेक्नोलॉजी इंस्टीट्यूट ऑफ Tabarestan (गाबित), साड़ी कृषि विज्ञान एवं प्राकृतिक संसाधन विश्वविद्यालय (सन्व) ने समर्थन दिया । जूनियर रिसर्च ग्रुप अजैव तनाव जीनोमिक्स को IZN (अनुशासनिक सेंटर फॉर क्रॉप प्लांट रिसर्च, हाले (Saale), जर्मनी द्वारा वित्तपोषित किया गया था । हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Rhonda मेयेर धंयवाद ।
Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K0221 | |
TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | K1631 | |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
96 well WHT/CLR | Bio-Rad | HSP9601 | |
Microseal B film | Bio-Rad | MJ-0558 | |
Low tube strip CLR | Bio-Rad | TLS0801 | |
Flat cap strips | Bio-Rad | TCS0803 | |
NanoDrop 2000 | Peqlab | ND-2000 | |
RNaseZAP | Ambion | 9780 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
RNase A, DNase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0523 | |
TRIZOL Reagent | Ambion | 15596026 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BIO RAD | 1855195 | |
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
Guanidine thiocyanate for molecular biology | Sigma-Aldrich | G9277 | |
Agarose – Nucleic Acid Electrophoresis | Sigma-Aldrich | A9414 | |
Boric Acid for molecular biology | AppliChem | A2940 | |
bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
ethidium bromide | AppliChem | A1151 | |
Gel documentation system | BIO RAD | Gel Doc 2000 |