Un haut-débit Assay Compatible pour évaluer l'efficacité des médicaments contre Macrophage repiquées<em> Mycobacterium tuberculosis</em
Summary
New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.
Abstract
The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.
Introduction
La tuberculose (TB) reste une menace pour la santé mondiale sérieuse malgré la disponibilité de traitements de chimiothérapie anti-tuberculose depuis plus de 40 ans 1. Cela est dû en partie à l'exigence pour des périodes de plus de 6 mois de traitement longs en utilisant de multiples combinaisons de médicaments, ce qui conduit à des patients non-conformité 2. L'émergence de la tuberculose résistante aux médicaments au cours des dernières années a encore aggravé les problèmes dans un domaine où un développement réussi des médicaments cliniquement approuvés est pratiquement inexistante 3. En effet, en dépit de l' anti-développement des antituberculeux exhaustive, un seul médicament a été approuvé par la FDA pour une utilisation clinique au cours des 40 dernières années 4. Ainsi, de nouvelles générations de médicaments anti-tuberculeux sont nécessaires de toute urgence pour remédier à ce problème.
Un problème clé dans la découverte de médicaments antituberculeux est le manque de succès du transfert à partir de composés ayant une activité in vitro à l' efficacité dans le cadre clinique= "référence externe"> 5, 6, 7. Initialement, les approches cibles basées ont été utilisés pour le dépistage de médicaments anti – Mtb 5, qui a échoué à traduire dans des cellules bactériennes entières. Même lorsque les cellules sont utilisées Mtb, elle est souvent réalisée en utilisant le bouillon cultivé des cultures, qui ne permettent pas de prédire avec précision l' efficacité du médicament in vivo , 8, 9. Ces problèmes ont été reconnus et des essais de criblage de médicaments contre les macrophages contenant Vtt ou Mtb latente ont été établis avec succès 8, 10, 11, 12. Toutefois, même ces tests plus avancés ne donnent pas suffisamment compte des barrières de pénétration que les médicaments rencontrent dans les lésions pulmonaires non-vascularisées, et dans les foyers nécrotiques sur le site de l'infection. Effectivement, Même pour la première ligne de médicaments antituberculeux rifampicine, le dosage sous-optimal a été remise en question en raison de l' insuffisance dans les tissus in vivo et cérébral liquide céphalo – rachidien (LCR) pénétration 13, 14, 15 ainsi qu'une diminution de l' efficacité contre intracellulaire Vtt 8, 9. En tant que tel, de nouveaux modèles et des analyses qui prennent en compte ces paramètres au cours du processus de développement avance rapide sans aucun doute améliorer la tuberculose des efforts de découverte de médicaments.
Pour répondre à ce besoin, nous avons récemment mis sur pied un bon marché, rapide et BSL-2 modèle d'infection de remplacement compatible pour les tests d'efficacité des médicaments Vtt 16. Ce modèle d'infection produit dense Vtt au sein de grandes structures globales macrophage, qui récapitulait les barrières de pénétration cellulaire physiologiquement pertinents et généré repiquées macrophage <em> Vtt avec un état physiologique modifié ressemblant Mtb latente. Vtt dérivée de ce modèle d'infection a été combiné avec le dosage résazurine de microtitrage (REMA) pour évaluer l' efficacité du médicament, ce qui a produit des résultats cohérents avec d' autres modèles d'infection intracellulaire et une bonne corrélation avec la capacité déclarée de médicaments courants TB pour atteindre des concentrations élevées de CSF par rapport à des concentrations sériques 16.
Ici , nous décrivons en détail la génération de Mtb / structures globales macrophage pour produire macrophage-repiquées Vtt approprié pour les tests de sensibilité aux médicaments en utilisant REMA. En particulier, nous montrons comment ce système d'infection pourrait être adapté à un format de 96 puits pour la compatibilité avec le criblage à des candidats médicaments anti-TB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons décrit en détail un modèle d'infection Vtt alternative appropriée pour les tests l' efficacité des médicaments. Ce modèle prend en compte deux facteurs clés qui devraient être donnés plus de considération au cours du processus de développement de médicaments antituberculeux précoce: la présence d'obstacles physiologiquement pertinents à la pénétration du médicament et des changements métaboliques de Vtt lors de l' infection. Alors que nous avons préc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Frank Wolschendorf for access to the Cytation 3 automated imaging plate reader. This work was funded in part by NIH grant R01-AI104499 to OK. Parts of the work were performed in the UAB CFAR facilities and by the UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, which are funded by NIH/NIAID P30 AI027767 and by NIH 5P30 AR048311.
Materials
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/ml stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
References
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B., et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
- Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
- Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
- Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
- Evangelopoulos, D., Fonseca, d. a., D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
- Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2′ epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).
- Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
- Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
- Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin?. Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
- van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment?. Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
- Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
- Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
- Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
- Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
- Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
- Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
- Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).
