Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos
Summary
This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.
Abstract
Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.
Introduction
O coração é o primeiro órgão funcional para desenvolver no embrião 1, 2. Em conjunto com o sistema circulatório, que fornece o oxigénio, nutrientes, e um mecanismo de eliminação de resíduos durante o desenvolvimento. Três semanas após a fertilização, o coração humano bate pela primeira vez e a sua regulação correcta é mantida por cardiomiócitos (CMS). A perda irreversível destas células especializadas é, por conseguinte, o problema fundamental subjacente a insuficiência cardíaca progressiva. Embora alguns organismos, tais como o peixe-zebra e Xenopus têm o potencial para a regeneração cardíaca, o coração de mamíferos adultos é mais limitada de 3, 5, 6. Assim, tendo em conta a função crítica do coração, não é surpreendente que a doença cardíaca é a causa principal de morte no mundo, sendo responsável por 600.000 mortes nos Estados Unidos sozinho 7. oguinte, terapias baseadas em células para reparar ou substituir o miocárdio lesado de forma eficiente são de grande interesse clínico.
O estudo seminal de Yamanaka e seus colegas 8 mostraram que a expressão forçada de quatro fatores de transcrição é suficiente para converter células de fibroblastos completamente diferenciadas para as células-tronco pluripotentes. No entanto, a capacidade tumorigénica de todas as estratégias de células estaminais pluripotentes tem sido uma preocupação crítica na sua utilização para fins terapêuticos. Isso motivou o campo científico para procurar métodos alternativos para transdiferenciam células, evitando um estágio pluripotente. Recentemente, vários grupos demonstraram a viabilidade desta estratégia, exibindo conversão directa de fibroblastos de rato para células de cardiomiócitos-like induzidas (iCLMs) com a expressão ectópica de fatores de transcrição GATA4, MEF2C, Tbx5, e mais tarde, HAND2 (GMT e GHMT , respectivamente) 9, 10. Furthermore, a mesma estratégia pode ser realizada in vivo e nos tecidos de origem humana-9, 11, 12. Estudos recentes puseram em evidência factores adicionais ou as vias de sinalização que pode ser modulada de modo a melhorar ainda mais a eficiência cardíaca reprogramação 13, 14, 15. Tomados em conjunto, estes estudos demonstram o potencial de transdiferenciação dirigido para terapias regenerativas. No entanto, a baixa eficiência de CM reprogramação, os mecanismos moleculares desconhecidos, reprodutibilidade inconsistente devido a diferenças metodológicas 16, e a heterogeneidade dos iCLMs permanecem sem solução.
A fim de avaliar diretamente iCLM heterogeneidade, foi elaborado um ensaio de uma única célula discreta e robusta para a identificação de desenvolvimento sarcomere e Specificatio linhagem cardíacaN-duas características necessárias de cardiomiócitos funcionais. Há pelo menos três tipos principais de CM no coração tal como definido pela sua localização e propriedades elétricas únicas: atrial (AM), ventricular (VM) e pacemaker (PM) 17, 18, 19, 20. Numa combinação orquestrada, eles permitem que a bombagem de sangue adequado. Durante a lesão cardíaca, um ou todos os subtipos pode ser afectada, e o tipo de terapia com células teriam de ser dirigida numa base de caso-a-caso. Atualmente, a maioria das estratégias de focar a geração global de cardiomiócitos, enquanto pouco trabalho está sendo feito para estudar os mecanismos moleculares que regulam a especificação subtipo.
Detalhes do estudo seguinte como quantificar adequadamente sarcômeros bem organizadas e identificar um conjunto diversificado de subtipos de cardiomiócitos. Usando um pacemaker (PM) do mouse repórter -específica, somos capazes de aplicar um iabordagem mmunocytochemical distinguir miócitos atriais induzidas-like (IAM), miócitos ventriculares induzidas-like (MIV), e induzidas miócitos PM-like (IPMS) 21. Com base em nossas observações, apenas as células que exibem organização sarcomere são capazes de batimento espontâneo. Esta plataforma reprogramação exclusivo permite avaliar o papel de determinados parâmetros na organização do sarcômero, especificação subtipo, e a eficiência da reprogramação CM na resolução de uma única célula.
Protocol
Representative Results
Discussion
O presente estudo fornece uma estratégia de reprogramação direta para a conversão de MEFs em um conjunto diversificado de subtipos cardíacas via expressão mediada por retrovírus da transcrição cardíaca fatores GATA4, MEF2C, Tbx5 e HAND2 (GHMT). Usando uma abordagem imunocoloração multiplex em combinação com um rato repórter específica do PM, somos capazes de identificar IAM, iVMS e IPMS em resolução de uma única célula. Um tal ensaio permite uma experimental sistema in vitro capaz de isolar …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.F.-P. was supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No.2015165336. N.V.M was supported by grants from the NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838), and the March of Dimes (#5-FY14-203). We acknowledge Young-Jae Nam, Christina Lubczyk, and Minoti Bhakta for their important contributions to protocol development and data analysis. We also thank John Shelton for valuable technical input and members of the Munshi lab for scientific discussion.
Materials
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8um/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100um cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45um Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6ml Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10X Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1X in H20 |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH20 |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 ml Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 ml Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
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