Оценка кардиомиоцитов подтипов После Транскрипция фактор опосредованного перепрограммирования эмбриональных фибробластов мыши
Summary
This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.
Abstract
Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.
Introduction
Сердце является первым функциональным органом для развития у эмбриона 1, 2. В сочетании с кровеносной системой, она поставляет кислород, питательные вещества и механизм утилизации отходов в процессе разработки. Через три недели после оплодотворения, человеческое сердце бьется в первый раз, и его надлежащее регулирование поддерживается кардиомиоцитов (КМВ). Поэтому необратимая потеря этих специализированных клеток является фундаментальным вопросом, лежащий в основе прогрессирующей сердечной недостаточности. В то время как некоторые организмы , такие как данио и Xenopus имеют потенциал для регенерации сердца, взрослого сердца млекопитающих является более ограниченным 3, 5, 6. Таким образом, учитывая критическую функцию сердца, это не удивительно , что болезнь сердца является ведущей причиной смерти в мире, что составляет 600000 смертей в одной только 7 Соединенных Штатах.refore, клеточная терапия эффективно отремонтировать или заменить травмированного миокард имеют большой клинический интерес.
Семенной исследование Яманака и его коллеги показали , что 8 принудительная экспрессия четырех факторов транскрипции является достаточным для превращения полностью дифференцированные клетки фибробласты в плюрипотентные стволовые клетки. Тем не менее, онкогенные мощность всех плюрипотентных стволовых клеток стратегий был серьезную озабоченность в их использовании в терапевтических целях. Это побудило научную область для поиска альтернативных методов трансдифференцироваться клеток, избегая при этом плюрипотентных стадии. В последнее время несколько групп показали целесообразность этой стратегии, показывая прямое преобразование фибробластов мыши в индуцированных кардиомиоцитов-подобных клеток (iCLMs) с эктопической экспрессии факторов транскрипции GATA4, MEF2C, Tbx5, а позже, Hand2 (GMT и GHMT , соответственно) 9, 10. Furthermore, та же стратегия может быть выполнена в естественных условиях и в тканях человека , полученных 9, 11, 12. Недавние исследования выделены дополнительные факторы или сигнальных путей , которые могут быть модулированы для дальнейшего повышения эффективности сердечной перепрограммирования 13, 14, 15. Взятые вместе, эти исследования демонстрируют потенциал направленной трансдифференцировки для регенеративной терапии. Тем не менее, низкая эффективность СМ перепрограммирования, неизвестных молекулярных механизмов, несовместимым воспроизводимости из – за методологических различий 16 и гетерогенный характер iCLMs остаются нерешенными.
Для того, чтобы непосредственно оценить iCLM гетерогенность, мы разработали дискретный и надежный анализ одноклеточного для идентификации развития саркомера и сердечной клонального specificatioп-две необходимые характеристики функциональных кардиомиоцитов. Есть по крайней мере три основных типа КМ в сердце , как это определено их местоположение и уникальными электрическими свойствами: предсердия (AM), желудочковая (VM) и кардиостимулятором (PM) 17, 18, 19, 20. В спланированных комбинации, они позволяют надлежащим перекачку крови. Во время травмы сердца, один или все подтипы могут быть затронуты, и тип клеточной терапии необходимо будет решаться на индивидуальной основе случая. В настоящее время большинство стратегий сосредоточиться на общей генерации кардиомиоцитов, в то время как небольшая работа делается для изучения молекулярных механизмов, которые регулируют спецификацию подтипа.
Следующее исследование подробно описано, как правильно определить количество хорошо организованных саркомеры и определить разнообразный набор кардиомиоцитов подтипов. Использование кардиостимулятора (ПМ) Определённые репортер мыши, мы можем применить Immunocytochemical подход , чтобы отличить наведенные предсердные типа миоцитов (IAM), индуцированное желудочковых типа миоцитов (IVM) и индуцированные PM-как миоциты (IPMS) 21. На основании наших наблюдений, только клетки, которые обладают организации саркомера способны спонтанного избиения. Эта уникальная перепрограммирование платформа позволяет оценить роль определенных параметров в организации саркомера, спецификации подтипа, и эффективность СМ перепрограммирования при разрешении одноклеточных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящее исследование представляет собой стратегию прямого перепрограммирования для превращения MEFs в разнообразный набор сердечных подтипов с помощью ретровируса-опосредованной экспрессии кардиального факторов транскрипции Gata4, MEF2C, Tbx5 и Hand2 (GHMT). Использование мультиплекс Иммуноо…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.F.-P. was supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No.2015165336. N.V.M was supported by grants from the NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838), and the March of Dimes (#5-FY14-203). We acknowledge Young-Jae Nam, Christina Lubczyk, and Minoti Bhakta for their important contributions to protocol development and data analysis. We also thank John Shelton for valuable technical input and members of the Munshi lab for scientific discussion.
Materials
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8um/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100um cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45um Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6ml Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10X Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1X in H20 |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH20 |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 ml Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 ml Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
References
- Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
- Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
- Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
- Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
- Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
- Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. Atrial cardiomyocyte calcium signalling. Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).
- Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
- Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Conner, D. A. . Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
- Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E., Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
- Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).
