Precision-cut Mouse Lung skivor att visualisera Live Pulmonary dendritiska celler
Summary
Vi beskriver ett förfarande för generering Precision-cut Lung skivor (PCLS) och immunfärgning dem att visualisera lokalisering av olika immuncelltyper i lungan. Vår protokoll kan utvidgas till att visualisera placeringen och funktionen hos många olika celltyper under olika förhållanden.
Abstract
Inandning av allergener och patogener framkallar flera ändringar i olika immuncelltyper i lungorna. Flödescytometri är en kraftfull teknik för kvantitativ analys av cellyteproteiner på immunceller, men det ger ingen information om de lokaliserings- och migrationsmönster av dessa celler i lungorna. På samma sätt kan kemotaxianalyser utföras för att undersöka potentialen hos celler att svara på kemotaktiska faktorer in vitro, men dessa analyser inte återge den komplexa miljö av den intakta lungan. I motsats till dessa tidigare nämnda metoder, kan placeringen av individuella celltyper inom lungan lätt visualiseras genom att generera Precision-cut Lung skivor (PCLS), färgning dem med kommersiellt tillgängliga, fluorescensetikette antikroppar, och visualisera sektionerna med konfokalmikroskopi. PCLS kan användas för både levande och fixerade lungvävnad, och skivorna kan omfatta områden som stor som en tvärsektion av en hel lob. Vi har använt detta protokoll för att framgångsrikt visualisera placeringen av ett stort antal olika celltyper i lungan, inklusive olika typer av dendritiska celler, makrofager, neutrofiler, T-celler och B-celler, såväl som strukturella celler såsom lymfatiska, endoteliala och epiteliala celler. Förmågan att visualisera cellulära interaktioner, såsom de mellan dendritiska celler och T-celler, i levande, tredimensionell lungvävnad, kan avslöja hur celler rör sig inom lungan och samverkar med varandra vid steady state och vid inflammation. Sålunda, när det används i kombination med andra förfaranden, såsom flödescytometri och kvantitativ PCR, kan PCLS bidra till en omfattande förståelse av cellulära händelser som ligger bakom allergiska och inflammatoriska sjukdomar i lungan.
Introduction
Efter inhalation av pro-inflammatoriska stimuli, såsom lipopolysackarid (LPS), finns det en koordinerad rörelse av immunceller till, inom och från lungan. Till exempel är neutrofiler snabbt rekryteras till lungparenkym och luftvägar. Dessutom är vissa professionella antigenpresenterande celler som är kända som konventionella dendritiska celler (CDCs) genomgå en relativt komplex migreringsmönster 1, 2. CDCs kan identifieras med användning av flödescytometri, delvis baserade på deras visning av ytan markör, CD11c. Distinkta undergrupper av DC: er kan särskiljas genom den differentiella ytexpression av CD103 och CD11b 3. Vid förvärvet inhalerad antigen, vissa CDCs lämna lungan och migrera genom lymfkärlen till lung-dränerande lymfkörtlar (LNS) där de presenterar peptider till antigenspecifika T-celler 4. Detta är en kritisk tidig händelse i inledningen av adaptiva immun responses. Av okänd anledning, dock inte alla CDCs som förvärvar inhalerade antigener lämna lungan, och många av dessa celler kvar i det organ i flera månader 5, 6. Denna observation kan delvis förklaras av den utvecklings anor av dessa celler eftersom monocyt-härledd CD11 + celler som saknar kemokinreceptorn, CCR7, är oförmögna att migrera till de regionala LNS 7, 8. Det verkar troligt att migrations potential CDCs också bestäms, åtminstone delvis, genom sin anatomiska position inom lungan. Emellertid är den exakta lokaliseringen av dessa olika populationer av CDCs i lungan inte fullständigt karakteriserad. En förbättrad kunskap om immunceller lokalisering i lungan, och de molekyler som styr det behövs en bättre förståelse för hur immunsystemet hos lungan blir aktiverad.
PCLS håller på att ökaly används som en ex vivo-metod för att visualisera cellulära positionering och cell-cellinteraktioner, under bibehållande av den strukturella integriteten hos lungarkitekturen 9, 10. PCLS har använts för att studera lungorna hos många arter, däribland möss, nötkreatur, apor, får, hästar och människor 11. En stor fördel med denna teknik är att ungefär 20 skivor kan framställas från en enda lob hos en mus lunga, vilket minskar antalet djur som behövs för individuella experiment. I stort sett alla immuncelltyper, inkluderande DCs, makrofager, neutrofiler och T-celler, är närvarande i PCLS och underhålla sina normala strukturer.
PCLS kan också användas för att studera kalciumsignalering och kontraktilitet av luftvägs- och glatta muskelceller efter behandling med acetylkolin 12 eller metakolin 13. I detta tillvägagångssätt är endast en liten del av lungan enalyzed mikroskopiskt, men en studie rapporterade att mätningar av luftvägssammandragning i PCLS varierar endast ca 10% från skivdel att skiva, och detta variansen är jämförbar med den som ses med användning av lungfunktionstest i intakta djur 14. Andra forskare har använt PCLS som en ex vivo tillvägagångssätt för att studera förändringar i cytokin expressions och cellytemarkörer efter inkubering med LPS 15. PCLS har också använts i en ex vivo modell av hypoxisk pulmonell kärlsammandragning i små intra-acinar artärer. Dessa fartyg är belägna i den del av lungan som inte kan nås med användning av andra förfaranden, inklusive inspelningar från dissekerade arteriella segment eller analys av subpleural kärl 16. Vårt laboratorium har främst använt PCLS att visualisera immunceller lokalisering i levande lungvävnad vid steady state och efter en in vivo inflammatorisk stimulans. Procedurerna vi har utvecklat för detta är följande.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs här utvecklades ursprungligen för att visualisera placeringen av två delmängder av CDCs i lungorna. Emellertid kan detta protokoll lätt anpassas för att studera många olika celltyper, medan cellviabiliteten och den tredimensionella arkitekturen hos lungan upprätthålla. Den sistnämnda funktionen är en viktig fördel jämfört med cellkultursystem och underlättar identifiering av sällsynta celltyper. Metoden förlitar sig på genereringen av PCLS från lungan, och en lämplig kombinat…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Jeff Tucker, Erica Scappini och Agnes Janoshazi för deras hjälp med mikroskopi, Ligon Perrow för sin hantering av musen kolonin, och Jun Chen och Michael Sanderson för hjälp med vävnaden slicer, och Michael Fessler och Derek Cain för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete har finansierats av intramural grenen av NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09), som i sin tur sponsras av Department of Health and Human Services.
Materials
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 006617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35mm petri dish, 14mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
- Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
- Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).
- Sung, S. S., et al. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).
- Jakubzick, C., et al. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).
- Julia, V., et al. A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure. Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).
- Nakano, H., et al. Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage. Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).
- Nakano, H., et al. Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells. J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology. Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).
- Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).
- Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies. Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).
- Paddenberg, R., et al. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir Res. 7, 93 (2006).
- Wilson, R. H., et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).
- Schlitzer, A., et al. Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow. Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).
- Baluk, P., et al. Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation. Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).
- Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium. Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).
- Truman, L. A., et al. ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets. Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).
- Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
