Precisie-cut Mouse Lung Slices Live Pulmonary visualiseren van dendritische cellen
Summary
We beschrijven een werkwijze voor het precisie-cut Lung Schijfjes (PCLS) en immunokleuring ze naar de lokalisatie van diverse immuun celsoorten te visualiseren in de longen. Ons protocol kan worden uitgebreid tot de locatie en de functie van vele verschillende celtypen te visualiseren onder verschillende omstandigheden.
Abstract
Inhalatie van allergenen en pathogenen opwekt meerdere wijzigingen in diverse immunologische celsoorten in de longen. Flowcytometrie is een krachtige techniek voor kwantitatieve analyse van celoppervlakte-eiwitten op immuuncellen, maar geeft geen informatie over de lokalisatie en migratie patronen van deze cellen in de longen. Evenzo kan chemotaxis assays worden uitgevoerd om het vermogen van cellen te bestuderen om te reageren op chemotactische factoren in vitro, maar deze testen niet reproduceren complexe omgeving van het intacte long. In tegenstelling tot deze bovengenoemde technieken kan de ligging van de verschillende celtypes in de longen gemakkelijk worden gevisualiseerd door het genereren precisie gesneden Lung Schijfjes (PCLS) kleuring hen commercieel verkrijgbare, fluorescent gemerkte antilichamen en visualiseren van de secties met confocale microscopie. PCLS kan worden gebruikt voor zowel live als longweefsel gefixeerd en de plakjes kan gebieden omvatten zo groot als een dwarsdoorsnede van een hele kwab. We hebben dit protocol gebruikt met succes visualiseren van de locatie van diverse celtypen in de long, waaronder verschillende soorten dendritische cellen, macrofagen, neutrofielen, T-cellen en B-cellen, en structurele cellen zoals lymfatische, endotheliale en epitheelcellen. Het vermogen om cellulaire interacties, zoals die tussen dendritische cellen en T-cellen, in levende, driedimensionale longweefsel zichtbaar, kan openbaren hoe cellen zich binnen de longen met elkaar bij steady state en bij inflammatie. Derhalve bij gebruik in combinatie met andere procedures, zoals stroomcytometrie en kwantitatieve PCR, kan PCLS bijdragen aan een beter begrip van cellulaire gebeurtenissen die allergische en inflammatoire longziekten grondslag liggen.
Introduction
Na inhalatie van pro-inflammatoire stimuli zoals lipopolysaccharide (LPS), is er een gecoördineerde beweging van immuuncellen in, binnen en uit de longen. Bijvoorbeeld worden neutrofielen snel aangeworven om het longparenchym en luchtwegen. Bovendien hebben sommige professionele antigeenpresenterende cellen bekend als conventionele dendritische cellen (CDCS) ondergaat een betrekkelijk ingewikkelde migratiepatroon 1, 2. CDCS kunnen worden geïdentificeerd met gebruik van doorstroomcytometrie, gedeeltelijk gebaseerd op de weergave van de oppervlaktemerker, CD11c. Verschillende subsets van DCs kan worden onderscheiden door het verschil oppervlakte-expressie van CD103 en CD11b 3. Bij het verwerven van geïnhaleerde antigeen, sommige CDCs verlaat de long en migreren door de lymfevaten to-long drainerende lymfeklieren (LN), waar ze presenteren peptiden op antigeen-specifieke T-cellen 4. Dit is een kritieke vroege gebeurtenis bij de initiatie van adaptieve immuunsysteem responses. Om onbekende redenen, echter niet alle CDCs dat geïnhaleerde antigenen verwerven verlaat de longen, en veel van deze cellen blijven in dat orgaan voor enkele maanden 5, 6. Deze waarneming kan gedeeltelijk worden verklaard door de ontwikkelings afstamming van deze cellen omdat monocyten afgeleide CD11c + cellen die de chemokine receptor CCR7, niet kunnen migreren naar regionale LN's 7, 8. Het lijkt waarschijnlijk dat de migratiepotentieel van CDC Ook wordt bepaald, ten minste gedeeltelijk, door de anatomische positie binnen de long. Echter, de precieze lokalisatie van deze verschillende populaties van CDC in de long niet volledig gekarakteriseerd. Een verbeterde kennis van immuuncel lokalisatie binnen de longen en van de moleculen die direct het, is nodig voor een beter begrip van hoe het immuunsysteem van de longen wordt geactiveerd.
PCLS worden dat verhogingly gebruikt als een ex vivo benadering voor cellulaire positionering en cel-cel interacties visualiseren, met behoud van de structurele integriteit van de long architectuur 9, 10. PCLS zijn gebruikt om de longen van de vele soorten, waaronder muizen, runderen, apen, schapen, paarden en mensen 11 te bestuderen. Een belangrijk voordeel van deze techniek is dat ongeveer 20 plakken kunnen worden bereid uit een kwab van een muislong, waardoor het aantal dieren om eigen proeven verminderen. Vrijwel alle immuun celtypen, met inbegrip van DCs, macrofagen, neutrofielen, en T-cellen, zijn aanwezig in PCLS en hun normale structuur te behouden.
PCLS kan ook worden gebruikt om calcium signalering en contractiliteit van de luchtwegen en gladde spiercellen studie na behandeling met acetylcholine 12 of 13 methacholine. In deze benadering slechts een klein deel van de long is eenmicroscopisch alyzed, maar een studie rapporteerde dat metingen van de luchtwegen inkrimping PCLS varieert slechts ongeveer 10% van plak tot plak, en dit verschil is vergelijkbaar met dat gebruikt longfunctietesten bij intacte dieren 14. Andere onderzoekers hebben PCLS een ex vivo benadering gebruikt om veranderingen in cytokine-expressie en celoppervlak markers na incubatie studie met 15 LPS. PCLS zijn ook gebruikt in een ex vivo model van hypoxische pulmonale vasoconstrictie in kleine intra-acinaire slagaders. Deze vaten liggen in het deel van de long die niet kunnen worden bereikt met andere procedures, waaronder opnamen van ontleed arteriële segmenten of analyse van subpleural vaten 16. Ons laboratorium heeft voornamelijk gebruikt PCLS om immuuncel lokalisatie in levende longweefsel bij steady state en naar aanleiding van een in vivo inflammatoire stimulus te visualiseren. De procedures die we hebben ontwikkeld voor dit zijn als volgt.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven protocol werd oorspronkelijk ontwikkeld om de locaties van twee subsets van CDC in de long zichtbaar. Echter, kan het protocol gemakkelijk worden aangepast aan vele verschillende celtypen te onderzoeken, met behoud van cellevensvatbaarheid en de driedimensionale architectuur van de long. De laatste is een belangrijk voordeel ten opzichte celkweeksystemen en vergemakkelijkt de identificatie van zeldzame celtypen. De werkwijze berust op het genereren van PCLS van de long, en een geschikte combinatie van…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Jeff Tucker, Erica Scappini en Agnes Janoshazi voor hun hulp bij microscopie, Ligon Perrow voor haar beheer van de muis kolonie, en Jun Chen en Michael Sanderson voor hulp bij het weefsel snijmachine, en Michael Fessler en Derek Cain voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door de intramurale tak van de NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09), die op zijn beurt wordt gesponsord door het Department of Health and Human Services.
Materials
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 006617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35mm petri dish, 14mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
- Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
- Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).
- Sung, S. S., et al. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).
- Jakubzick, C., et al. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).
- Julia, V., et al. A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure. Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).
- Nakano, H., et al. Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage. Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).
- Nakano, H., et al. Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells. J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology. Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).
- Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).
- Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies. Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).
- Paddenberg, R., et al. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir Res. 7, 93 (2006).
- Wilson, R. H., et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).
- Schlitzer, A., et al. Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow. Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).
- Baluk, P., et al. Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation. Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).
- Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium. Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).
- Truman, L. A., et al. ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets. Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).
- Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
