coupe de précision de la souris Tranches Lung pour visualiser les cellules vivantes pulmonaire dendritiques
Summary
Nous décrivons un procédé pour générer des tranches de poumon couper avec précision (PCLS) et les immunocoloration pour visualiser la localisation de divers types de cellules immunitaires dans le poumon. Notre protocole peut être étendu pour visualiser l'emplacement et la fonction de différents types de cellules dans une variété de conditions.
Abstract
L'inhalation d'allergènes et d'agents pathogènes provoque plusieurs changements dans une variété de types de cellules immunitaires dans les poumons. La cytométrie en flux est une technique puissante pour l'analyse quantitative des protéines de surface cellulaire sur les cellules immunitaires, mais il ne fournit aucune information sur les schémas de localisation et de migration de ces cellules dans le poumon. De même, les tests de chimiotaxie peuvent être effectués pour étudier le potentiel des cellules à répondre à des facteurs chimiotactiques in vitro, mais ces tests ne se reproduisent pas à l'environnement complexe du poumon intact. Contrairement à ces techniques mentionnées ci-dessus, l'emplacement des types cellulaires individuels dans le poumon peut être visualisé facilement en générant des tranches de poumon coupe de précision (PCLS), leur coloration avec disponibles dans le commerce, des anticorps par fluorescence marqués, et la visualisation des sections par microscopie confocale. PCLS peuvent être utilisés pour les vivre et les tissus pulmonaires fixes, et les tranches peuvent englober des domaines aussi grande qu'une section transversale d'un lobe entier. Nous avons utilisé ce protocole pour visualiser avec succès l'emplacement d'une grande variété de types de cellules dans les poumons, y compris les types distincts de cellules dendritiques, les macrophages, les neutrophiles, les lymphocytes T et les cellules B, ainsi que les cellules structurelles telles que lymphatique, endothéliale et cellules épithéliales. La capacité à visualiser les interactions cellulaires, telles que celles entre les cellules dendritiques et les cellules T, en temps réel, le tissu pulmonaire en trois dimensions, peut révéler comment les cellules se déplacent dans le poumon et interagir avec l'autre à l'état stable et pendant l'inflammation. Ainsi, lorsqu'il est utilisé en combinaison avec d'autres procédures, telles que cytométrie en flux et la PCR quantitative, PCLS peut contribuer à une compréhension globale des événements cellulaires qui sous-tendent les maladies allergiques et inflammatoires du poumon.
Introduction
À la suite de l'inhalation de stimuli pro-inflammatoires tels que lipopolysaccharide (LPS), il y a un mouvement coordonné de cellules immunitaires dans, à l'intérieur et du poumon. Par exemple, les neutrophiles sont rapidement recrutés pour le parenchyme pulmonaire et des voies respiratoires. En outre, certaines cellules présentatrices d'antigène professionnelles appelées cellules dendritiques classiques (CDCS) subissent un motif de migration relativement complexe 1, 2. CDCS peuvent être identifiés par cytométrie de flux, basés en partie sur leur affichage du marqueur de surface, CD11c. Sous – ensembles distincts de DC peuvent être distingués par l'expression de surface différentielle de CD103 et CD11b 3. Lors de l' acquisition de l' antigène inhalé, certains CDCS sortent du poumon et migrent à travers les vaisseaux lymphatiques vers les ganglions lymphatiques drainant __gVirt_NP_NN_NNPS<__ pulmonaires (__gVirt_NP_NNS_NNPS<__ LNS) où ils présentent des peptides à des cellules T spécifiques de l' antigène 4. Ceci est un événement précoce critique dans l'initiation de r immunitaire adaptatifEPONSES. Pour des raisons inconnues, cependant, tous les CDCS qui acquièrent des antigènes inhalés quittent le poumon, et bon nombre de ces cellules restent dans cet organe pendant plusieurs mois 5, 6. Cette observation peut être expliqué en partie par l'origine du développement de ces cellules car CD11c + dérivées de monocytes des cellules dépourvues du récepteur de chimiokines, CCR7, ne parviennent pas à migrer vers les ganglions régionaux 7, 8. Il semble probable que le potentiel de migration des CDCS est également déterminée, au moins en partie, par leur position anatomique dans le poumon. Cependant, la localisation précise de ces différentes populations de CDCS dans le poumon n'est pas complètement caractérisée. Une meilleure connaissance de la localisation des cellules immunitaires dans le poumon, et des molécules qui dirigent, est nécessaire pour une meilleure compréhension de la façon dont le système immunitaire du poumon est activé.
PCLS sont en augmentationly utilisé comme une approche ex vivo pour visualiser les interactions de positionnement cellulaire et cellule-cellule, tout en maintenant l'intégrité structurelle de l'architecture du poumon 9, 10. PCLS ont été utilisés pour étudier les poumons de nombreuses espèces, y compris les souris, les bovins, les singes, les moutons, les chevaux et les humains 11. Un avantage majeur de cette technique est que environ 20 tranches peuvent être préparées à partir d'un seul lobe d'un poumon de souris, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour des expériences individuelles. Pratiquement tous les types de cellules immunitaires, y compris les contrôleurs de domaine, les macrophages, les neutrophiles et les lymphocytes T, sont présents dans PCLS et de maintenir leurs structures normales.
PCLS peut également être utilisé pour étudier la signalisation du calcium et de la contractilité des voies respiratoires et les cellules musculaires lisses après le traitement avec acétylcholine 12 ou 13 méthacholine. Dans cette approche, seule une petite partie du poumon est unalyzed microscopiquement, mais une étude a rapporté que les mesures de la contraction des voies respiratoires dans PCLS varient seulement environ 10% de la tranche à tranche, et cet écart est comparable à celle observée en utilisant des tests de la fonction pulmonaire chez les animaux intacts 14. D' autres chercheurs ont utilisé PCLS comme une approche ex vivo pour étudier les changements dans l' expression des cytokines et des marqueurs de surface cellulaire après incubation avec du LPS 15. PCLS ont également été utilisés dans un modèle ex vivo de la vasoconstriction pulmonaire hypoxique dans les petites artères intra-acineuses. Ces navires sont situés dans la partie du poumon qui ne peut être atteint en utilisant d' autres procédures, y compris des enregistrements de segments artériels ou disséqués analyse des vaisseaux pleuraux 16. Notre laboratoire a principalement utilisé PCLS pour visualiser la localisation des cellules immunitaires dans le tissu pulmonaire en direct à l'équilibre et à la suite d' un stimulus inflammatoire in vivo. Les procédures que nous avons mis au point pour ce sont les suivantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici a été initialement développé pour visualiser l'emplacement des deux sous-ensembles de CDCS dans le poumon. Cependant, ce protocole peut être facilement adapté à l'étude de différents types de cellules, tout en maintenant la viabilité des cellules et l'architecture en trois dimensions du poumon. Cette dernière caractéristique est un avantage important par rapport aux systèmes de culture cellulaire et facilite l'identification des types de cellules rares. La méthode r…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Jeff Tucker, Erica Scappini, et Agnes Janoshazi pour leur aide à la microscopie, Ligon Perrow pour sa gestion de la colonie de la souris, et Jun Chen et Michael Sanderson pour aider à la trancheuse de tissus, et Michael Fessler et Derek Cain pour la lecture critique le manuscrit. Ce travail a été financé par la branche intra-muros du NIEHS, le NIH (ZIA ES102025-09), qui est à son tour parrainé par le ministère de la Santé et des Services sociaux.
Materials
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 006617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35mm petri dish, 14mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
- Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
- Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).
- Sung, S. S., et al. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).
- Jakubzick, C., et al. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).
- Julia, V., et al. A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure. Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).
- Nakano, H., et al. Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage. Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).
- Nakano, H., et al. Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells. J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology. Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).
- Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).
- Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies. Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).
- Paddenberg, R., et al. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir Res. 7, 93 (2006).
- Wilson, R. H., et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).
- Schlitzer, A., et al. Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow. Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).
- Baluk, P., et al. Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation. Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).
- Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium. Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).
- Truman, L. A., et al. ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets. Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).
- Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
