Taglio di precisione polmone mouse Fette per la visualizzazione in diretta cellule dendritiche polmonare
Summary
Si descrive un metodo per la generazione di precisione intercettato Lung fette (PCLS) e immunocolorazione loro di visualizzare la localizzazione dei vari tipi di cellule immunitarie nel polmone. Il nostro protocollo può essere esteso per visualizzare la posizione e la funzione dei diversi tipi di cellule in una varietà di condizioni.
Abstract
L'inalazione di allergeni e agenti patogeni suscita più modifiche in una varietà di tipi di cellule del sistema immunitario nel polmone. La citometria a flusso è una tecnica potente per l'analisi quantitativa di proteine di superficie cellulare sulle cellule immunitarie, ma non fornisce informazioni sulla localizzazione e migrazione modelli di queste cellule all'interno del polmone. Analogamente, analisi chemiotattica possono essere eseguite per studiare il potenziale delle cellule di rispondere a fattori chemiotattici in vitro, ma questi test non riproducono l'ambiente complesso del polmone intatto. In contrasto con queste tecniche di cui sopra, la posizione di tipi di cellule individuali all'interno del polmone può essere facilmente visualizzato generando precisione intercettato Lung fette (PCLS), loro colorazione con anticorpi commercialmente disponibili, fluorescente tag, e la visualizzazione delle sezioni al microscopio confocale. PCLS possono essere utilizzati sia per vivere e fissati tessuto polmonare, e le fette possono comprendere aree grandi come una sezione trasversale di un intero lobo. Abbiamo usato questo protocollo per visualizzare correttamente la posizione di una grande varietà di tipi di cellule del polmone, inclusi tipi distinti di cellule dendritiche, macrofagi, neutrofili, cellule T e B, così come le cellule strutturali come linfatica, endoteliale, e cellule epiteliali. La capacità di visualizzare interazioni cellulari, come quelle tra cellule dendritiche e cellule T, in, tessuto polmonare tridimensionale in tempo reale, può rivelare come cellule si muovono all'interno del polmone e interagiscono tra loro allo stato stazionario e durante l'infiammazione. Così, quando usato in combinazione con altre procedure, come la citometria di flusso e PCR quantitativa, PCLS può contribuire ad una comprensione completa di eventi cellulari che sono alla base delle malattie allergiche e infiammatorie del polmone.
Introduction
Dopo l'inalazione di stimoli pro-infiammatori quali lipopolisaccaride (LPS), v'è un movimento coordinato delle cellule immunitarie verso, all'interno, e dal polmone. Ad esempio, i neutrofili vengono rapidamente reclutati al parenchima polmonare e delle vie aeree. Inoltre, alcune cellule presentanti l'antigene professionali conosciute come cellule dendritiche convenzionali (CDC) subiscono un modello migratorio relativamente complesso 1, 2. CDC possono essere identificati usando la citometria a flusso, basati in parte sulla loro visualizzazione del marcatore di superficie, CD11c. Sottoinsiemi distinti di DC si distinguono per l'espressione di superficie differenziale di CD103 e CD11b 3. Acquistando antigene inalatoria, alcuni CDC uscire dal polmone e migrano attraverso i vasi linfatici polmonari drenante linfonodi (LNS) quando queste presentano peptidi alle cellule T antigene-specifiche 4. Questo è un evento precoce critica l'avvio di adattativo r immunitarioesponses. Per ragioni sconosciute, tuttavia, non tutti i CDC che acquisiscono gli antigeni inalati lasciano il polmone, e molte di queste cellule rimangono in quell'organo per diversi mesi 5, 6. Questa osservazione può essere spiegato in parte gli antenati sviluppo di queste cellule derivate da monociti perché CD11c + cellule privi del recettore delle chemochine, CCR7, sono in grado di migrare verso LNs regionali 7, 8. Sembra probabile che il potenziale di migrazione CDCs è anche determinata, almeno in parte, dalla loro posizione anatomica nel polmone. Tuttavia, la localizzazione precisa di queste diverse popolazioni di CDCS nel polmone non è completamente caratterizzato. Una migliore conoscenza della localizzazione delle cellule immunitarie all'interno del polmone, e delle molecole che si dirigono, è necessario per una migliore comprensione del modo in cui il sistema immunitario del polmone si attiva.
PCLS stanno essendo in aumentoly utilizzato come approccio ex vivo per visualizzare posizionamento cellulare e interazioni cellula-cellula, mantenendo l'integrità strutturale dell'architettura polmone 9, 10. PCLS sono stati utilizzati per studiare i polmoni di molte specie, tra cui topi, bovini, scimmie, pecore, cavalli, e gli esseri umani 11. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che circa 20 fette possono essere preparati da un singolo lobo di un polmone mouse, riducendo così il numero di animali necessari per esperimenti singoli. Praticamente tutti i tipi di cellule immunitarie, compresi DC, macrofagi, neutrofili e le cellule T, sono presenti in PCLS e mantenere le loro strutture normali.
PCLS può anche essere usato per studiare calcio di segnalazione e di contrattilità cellule delle vie aeree e muscolari lisce dopo il trattamento con l'acetilcolina 12 o 13 metacolina. In questo approccio, solo una piccola parte del polmone è unalyzed microscopicamente, ma uno studio ha riportato che le misurazioni di contrazione vie aeree in PCLS variano solo circa il 10% da fetta a fetta, e questa variazione è paragonabile a quella osservata utilizzando test di funzionalità polmonare in animali intatti 14. Altri ricercatori hanno utilizzato PCLS come approccio ex vivo per studiare i cambiamenti nei marcatori espressione di citochine e di superficie cellulare dopo incubazione con LPS 15. PCLS sono stati utilizzati anche in un modello ex vivo di vasocostrizione ipossica polmonare nelle piccole arterie intra-acinare. Questi vasi sono situati nella parte del polmone che non può essere raggiunta utilizzando altre procedure, comprese le registrazioni da segmenti arteriosi sezionato o analisi dei vasi subpleuriche 16. Il nostro laboratorio è principalmente utilizzato PCLS di visualizzare la localizzazione delle cellule immunitarie nel tessuto polmonare dal vivo a regime e dopo uno stimolo infiammatorio in vivo. Le procedure che abbiamo sviluppato per questo sono i seguenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto è stato originariamente sviluppato per visualizzare le posizioni dei due sottoinsiemi di CDC all'interno del polmone. Tuttavia, questo protocollo può essere facilmente adattato per studiare diversi tipi di cellule, mantenendo la vitalità delle cellule e l'architettura tridimensionale del polmone. Quest'ultima caratteristica è un importante vantaggio rispetto ai sistemi di coltura cellulare e permette l'identificazione di tipi di cellule rare. Il metodo si basa sulla genera…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Jeff Tucker, Erica Scappini, e Agnes Janoshazi per il loro aiuto con la microscopia, Ligon Perrow per la sua gestione della colonia del mouse, e Jun Chen e Michael Sanderson per un aiuto con l'affettatrice del tessuto, e Michael Fessler e Derek Cain per la lettura critica di il manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dal ramo intramurale del NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09), che è a sua volta sponsorizzato dal Dipartimento di Salute e Servizi Umani.
Materials
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 006617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35mm petri dish, 14mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
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