정밀 절단 라이브 폐 수지상 세포를 시각화하기 위해 마우스 폐 슬라이스
Summary
우리는 정밀 컷 폐 조각 (PCLS)를 생성하고, 폐에 다양한 면역 세포 유형의 현지화를 시각화하도록 면역 염색하는 방법을 설명합니다. 우리의 프로토콜은 다양한 조건 하에서 위치와 다양한 세포 유형의 기능을 시각화 할 수 있도록 확장 할 수 있습니다.
Abstract
알러지 유발 물질과 병원균의 흡입은 폐의 면역 세포 유형의 다양한 여러 변화를 이끌어 낸다. 유동 세포 계측법은 면역 세포에 세포 표면 단백질의 정량 분석을위한 강력한 기술이지만, 폐 내에서 이러한 세포의 현지화 및 이동 패턴에 관한 정보를 제공하지 않습니다. 마찬가지로, 화성 분석은 체외에서 화학 주성 인자에 반응하는 세포의 가능성을 연구하기 위해 수행 할 수 있지만, 이러한 분석은 그대로 폐의 복잡한 환경을 재현하지 않습니다. 이러한 전술 한 기술들에 대조적으로, 폐 내의 각각의 세포 유형의 위치를 용이하게 시판되는 형광 태그 항체로 염색 정밀 절단 폐 조각 (PCLS)를 생성하고, 공 초점 현미경에 의해 부분을 시각화 시각화 할 수있다. PCLS 살 모두 사용과 폐 조직을 고정하고, 슬라이스 전체 엽 단면 한 큰 영역을 포괄 할 수있다. 우리는 성공적으로 수지상 세포의 구별 유형, 대 식세포, 호중구, T 세포와 B 세포뿐만 아니라, 림프, 내피 등의 구조 세포를 포함 폐에서 세포 유형의 다양한의 위치를 시각화하기 위해이 프로토콜을 사용하고있다 상피 세포. 세포가 폐 내에서 이동 및 정상 상태에서 염증 동안 서로 상호 작용하는 방식을 라이브, 입체 폐 조직에서 수지상 세포와 T 세포 사이 것과 같은 세포 상호 작용을 시각화하는 능력은 공개 할 수 있습니다. 같은 유동 세포 계측법 및 정량 PCR과 같은 다른 절차와 함께 사용하는 경우 따라서, PCLS는 폐의 알레르기 성 및 염증성 질환의 기초가 세포 사건의 포괄적 인 이해에 기여할 수있다.
Introduction
이러한 지질 다당류 (LPS)와 같은 염증성 자극의 흡입 후,이 내에 면역 세포의 조정 움직임, 그리고 폐에서. 예를 들어, 호중구는 빠르게 폐 실질과기도로 모집하고 있습니다. 또한, 종래의 수지상 세포 (CDCS)로 알려진 몇몇 전문 항원 제시 세포는 비교적 복잡한 이동 패턴 1, 2 겪는다. CDCS은 표면 마커들의 디스플레이하는 CD11c에 부분적으로 유세포하여 식별 기초 할 수있다. 수지상 고유 서브 세트 CD103 및 CD11b를 3 차 표면 발현에 의해 구별 될 수있다. 흡입 된 항원을 취득하면, 일부 CDCS 폐 빠져가 항원 특이 적 T 세포 위해 4 펩티드를 제시 폐 배수 림프절 (림프절)에 림프관을 통해 이동한다. 이 적응성 면역 연구의 시작에 중요한 초기 이벤트esponses. 알 수없는 이유로, 그러나, 흡입 항원을 획득 모든 CDCS는 폐를 떠나, 이러한 세포의 대부분은 몇 달 5 해당 기관에서 6 남아있다. 단핵구 유래의 CD11c + 케모카인 수용체, CCR7 부족한 세포, 지역 림프절 7, 8로 마이그레이션 할 수없는 때문에 이러한 관찰은 부분적으로 이러한 세포의 발달 조상에 의해 설명 될 수있다. CDCS의 이동 가능성도 폐 내에서의 해부학 적 위치에 의해 적어도 부분적으로 결정되는 것으로 보인다. 그러나, 폐 CDCS의 서로 다른 집단의 정확한 현지화 완전히 특징되지 않습니다. 폐 내에서, 그리고 직접 분자의 면역 세포 지역화의 개선 된 지식, 폐의 면역 체계가 활성화됩니다 방법에 대한 더 나은 이해를 위해 필요합니다.
PCLS이되고 증가하고있다폐 구조 (9), (10)의 구조적 일체 성을 유지하면서, LY는 셀룰러 위치 및 세포 – 세포 상호 작용을 시각화하기위한 생체 외 방법으로 사용된다. PCLS은 쥐, 소, 원숭이, 양, 말, 인간 (11)를 포함하여 많은 종의 폐를 연구하는 데 사용되었다. 이 기술의 주요 장점은 약 20 분할함으로써 개별 실험에 필요한 동물의 수를 줄이고, 마우스 폐 단일 로브로부터 제조 될 수 있다는 것이다. 수지상 세포, 대 식세포, 호중구 및 T 세포를 포함하여 거의 모든 면역 세포 유형은 PCLS에 존재하고 그들의 정상적인 구조를 유지한다.
PCLS은 아세틸 콜린 (12) 또는 메타 (13)와 치료 후 칼슘 신호 및기도 평활근 세포의 수축력을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방식에서, 폐의 작은 부분은 인현미경 alyzed하지만, 한 연구는 PCLS에서기도 수축의 측정 슬라이스 조각에서 약 10 %을 변화하고,이 차이는 그대로 동물 (14)에 폐 기능 검사를 사용하여 볼에 필적이라고보고했다. 다른 연구자들은 LPS (15)와 함께 배양 한 후 사이토 카인의 발현 및 세포 표면 마커의 변화를 연구하기 위해 체외 방식으로 PCLS을 사용했다. PCLS 또한 작은 내 선방 동맥 저산소 성 폐 혈관 수축의 체외 모델에서 사용되어왔다. 이 선박은 해부 동맥 세그먼트 또는 subpleural 용기 (16)의 분석 등을 포함하여 기타 절차를 사용하여 도달 할 수없는 폐의 부분에 있습니다. 우리 연구실은 주로 생체 내 염증 자극 다음과 면역 세포의 정상 상태에서 라이브 폐 조직의 현지화 및 시각화 PCLS을 사용하고있다. 다음과 같이 우리가 개발 한 절차이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 원래의 폐 CDCS의 두 부분 집합의 위치를 시각화하기 위해 개발되었다. 그러나,이 프로토콜은 쉽게 세포 생존 및 폐의 3 차원 구조를 유지하면서, 다양한 세포 유형을 공부하고 적용 할 수 있습니다. 후자의 기능은 세포 배양 시스템에 비해 중요한 장점이다 희귀 세포 유형의 식별을 용이하게한다. 상기 방법은 폐에서 PCLS의 발생에 의존하고, 배경 얼룩을 최소화하면…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 현미경과의 도움을 제프 터커, 에리카 스카피니, 그리고 아그네스 Janoshazi 감사합니다, 비판적 읽기 마우스 식민지의 그녀 관리를위한 라이곤 페로우 및 준 첸와 마이클 샌더슨 조직 슬라이서에 대한 도움말, 마이클 Fessler 데릭 가인 원고. 이 작품은 결과적으로 보건 복지부가 후원하는 NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09)의 교내 지점에 의해 투자되었다.
Materials
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 006617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35mm petri dish, 14mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
- Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
- Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).
- Sung, S. S., et al. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).
- Jakubzick, C., et al. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).
- Julia, V., et al. A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure. Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).
- Nakano, H., et al. Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage. Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).
- Nakano, H., et al. Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells. J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology. Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).
- Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).
- Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies. Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).
- Paddenberg, R., et al. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir Res. 7, 93 (2006).
- Wilson, R. H., et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).
- Schlitzer, A., et al. Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow. Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).
- Baluk, P., et al. Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation. Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).
- Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium. Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).
- Truman, L. A., et al. ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets. Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).
- Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
