Rato pulmão Slices para Visualize células vivas pulmonar dendríticas precisão de corte

Summary

Descreve-se um método para a geração de corte de precisão pulmonar fatias (PCLS) e imunocoloração-los para visualizar a localização de vários tipos de células imunitárias no pulmão. Nosso protocolo pode ser estendido para visualizar a localização e função de muitos tipos diferentes de células sob uma variedade de condições.

Abstract

A inalação de alérgenos e agentes patogénicos elicia várias alterações em uma variedade de tipos de células imunitárias no pulmão. Citometria de fluxo é uma técnica poderosa para a análise quantitativa das proteínas da superfície celular em células do sistema imunológico, mas não fornece nenhuma informação sobre os padrões de localização e de migração destas células dentro do pulmão. Do mesmo modo, ensaios de quimiotaxia pode ser realizada para estudar o potencial das células para responder a factores quimiotáticos in vitro, mas estes ensaios não reproduzem o ambiente complexo do pulmão intacta. Em contraste com estas técnicas acima mencionadas, a localização de tipos de células individuais dentro do pulmão pode ser facilmente visualizado através da geração de precisão de corte fatias de pulmão (PCLS), manchando-os com anticorpos comercialmente disponíveis, marcados por fluorescência, e visualizando as secções por microscopia confocal. PCLS pode ser utilizado tanto para viver e fixa o tecido pulmonar, e as fatias pode abranger áreas tão grandes como uma secção transversal de um lobo inteiro. Nós temos utilizado este protocolo para visualizar com sucesso o local de uma ampla variedade de tipos de células no pulmão, incluindo tipos distintos de células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células T e células B, assim como células estruturais tais como linfático, endotelial e células epiteliais. A habilidade de visualizar as interacções celulares, tais como aquelas entre as células dendríticas e as células T, no tecido pulmonar vivo, tridimensional, pode revelar como células se movem no interior do pulmão e interagir uns com os outros no estado estacionário e durante a inflamação. Assim, quando usado em combinação com outros procedimentos, tais como citometria de fluxo e PCR quantitativa, PCLS pode contribuir para uma compreensão abrangente de eventos celulares que fundamentam as doenças alérgicas e inflamatórias do pulmão.

Introduction

Após a inalação de estímulos pró-inflamatórios, tais como lipopolissacáridos (LPS), há um movimento coordenado de células imunes para, dentro de, e do pulmão. Por exemplo, os neutrófilos são rapidamente recrutados para o parênquima pulmonar e das vias aéreas. Além disso, algumas células apresentadoras de antigénios profissionais conhecidos como células dendríticas convencionais (CDCs) sofrem um padrão de migração relativamente complexo ^{1, 2.} CDCs podem ser identificados por citometria de fluxo, com base, em parte, a sua exposição do marcador de superfície, CD11c. Subconjuntos distintos de DCs pode ser distinguida pela expressão de superfície diferencial de CD103 e CD11b ^3. Após a aquisição de antigénio inalado, algumas CDCs sair do pulmão e migram através dos vasos linfáticos de drenagem pulmonares Nódulos Linfáticos (LNs) onde apresentam péptidos de antigénio-específica de células T ^4. Este é um evento precoce crítico na iniciação de r imune adaptativaesponses. Por razões desconhecidas, no entanto, nem todos os CDCs que adquirem antígenos inalados deixar o pulmão, e muitas destas células permanecem nesse órgão durante vários meses ^{5, 6.} Esta observação pode ser parcialmente explicado pela ascendência desenvolvimento destas células porque CD11c ⁺ células sem o receptor de quimiocina, CCR7 derivadas de monitos, são incapazes de migrar para LNs regionais ^{7, 8.} Parece provável que o potencial de migração de CDCs também é determinado, pelo menos em parte, pela sua posição anatômica dentro do pulmão. No entanto, a localização exacta destas diferentes populações de CDCs no pulmão não está completamente caracterizada. Um melhor conhecimento de localização de células imunitárias no interior do pulmão, e das moléculas que dirigem-lo, é necessário para uma melhor compreensão de como o sistema imune do pulmão torna-se activado.

PCLS estão sendo cada vez maiorly usado como uma abordagem ex vivo para visualizar posicionamento celular e interacções célula-célula, enquanto mantém a integridade estrutural da arquitectura pulmonar ^{9, 10.} PCLS têm sido usadas para estudar os pulmões de muitas espécies, incluindo ratos, gado, macacos, ovelhas, cavalos e seres humanos ^11. Uma importante vantagem desta técnica é que cerca de 20 fatias pode ser preparado a partir de um único lóbulo do pulmão do rato, reduzindo assim o número de animais necessários para as experiências individuais. Virtualmente todos os tipos de células imunitárias, incluindo as DCs, macrófagos, neutrófilos e células T, estão presentes em PCLS e manter as suas estruturas normais.

PCLS também pode ser utilizado para estudar a sinalização de cálcio e a contractilidade de células das vias respiratórias e do músculo liso após o tratamento com ¹² ou acetilcolina metacolina ^13. Nesta abordagem, apenas uma pequena porção do pulmão é umalyzed microscopicamente, mas um estudo relatou que as medições de contracção das vias aéreas em PCLS variar apenas cerca de 10% a partir de fatia a fatia, e esta variação é comparável à observada usando testes da função pulmonar em animais intactos ^14. Outros investigadores têm utilizado PCLS como uma abordagem ex vivo para estudar alterações na expressão de citoquinas e marcadores de superfície celular após incubação com LPS ^15. PCLS também têm sido utilizados num modelo ex vivo de vasoconstrição pulmonar hipóxica em pequenas artérias intra-acinares. Estes vasos estão localizados na parte do pulmão que não pode ser alcançado utilizando outros processos, incluindo gravações de segmentos ou análise de vasos arteriais subpleurais ¹⁶ dissecados. O nosso laboratório tem usado principalmente PCLS para visualizar a localização de células imunitárias em tecidos de pulmão vivo no estado estacionário e na sequência de um estímulo inflamatório in vivo. Os procedimentos que desenvolvemos para isso são as seguintes.

Protocol

procedimentos experimentais animais descritos no presente documento foram aprovados pelo Comité de Cuidados e NIEHS animal Uso (IACUC). 1. Preparação do pulmão ratos de casa entre 6 e 12 semanas de idade em condições específicos isentos de agentes patogénicos, de acordo com as orientações fornecidas pelos Comitês de Cuidado e Uso Institucional animais. NOTA: Imaged ratos pode ser ingênuo, ou tratados, dependendo dos interesses específicos de cada pesquisador. A…

Representative Results

Para identificar a localização de dois subconjuntos de DC, CD11b CDCs hi e CD103 + CDCs, PCLS de ratinhos C57BL / 6 foram cortadas e coradas com anticorpos monoclonais (mAbs) específicos para CD11c, CD88, CD103, CD324 e (E-caderina). Os anticorpos para as células epiteliais das vias respiratórias, CD324 mancha e CD88 é apresentado sobre os macrófagos e neutrófilos, mas não CDCs 8. Isto permitiu-nos distinguir CDCs de CD11c +</su…

Discussion

O protocolo aqui descrito foi originalmente desenvolvido para visualizar os locais de dois subconjuntos de CDCs dentro do pulmão. No entanto, este protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar muitos tipos de células diferentes, mantendo ao mesmo tempo a viabilidade celular e a arquitectura tridimensional do pulmão. A última característica é uma vantagem importante em relação aos sistemas de cultura de células e facilita a identificação de tipos de células raras. O método baseia-se na geração de PCL…

Materials

C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	000664
Prox1-TdTomato transgenic mice	Jackson Laboratory	018128	B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J
OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice	Jackson Laboratory	004194, 006617	B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J
Rag1 knock-out mice	Jackson Laboratory	002216	B6.129S7-Rag1tm1Mom/J
Ovalbumin, Low Endo, Purified	Worthington Biochemical Corporation	LS003059
Lipopolysaccharides from Escherichia coli	Sigma-Aldrich Co.	L2630-25MG
Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft	BD Diagnostic Systems	427421	0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter
GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose	BioExpress	E-3112-125	2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C.
Compresstome VF-300	Precisionary Instruments, Inc.	VF-300
Double Edge Stainless Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	72000	Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung.
Krazy Glue All Purpose Instant Gel	VWR	500033-484	Commonly available for $3/tube in local drugstores
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	ThermoFisher Scientific	21083027
Normal Rat Serum	Jackson ImmunoResearch Inc.	012-000-120
Normal Mouse Serum	Jackson ImmunoResearch Inc.	015-000-120
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30071.03HI
Staining Buffer	Made in House	N/A	PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4
Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies)	Made in House	N/A	Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2
Anti-mouse CD11b eFluor 450	eBioscience	48-0112-80	Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70)
Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605	BioLegend	101237	Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70)
Anti-mouse CD11c Phycoerythrin	eBioscience	12-0114-82	PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418)
Anti-mouse CD11c Allophycocyanin	BD Phamingen	550261	APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3)
Anti-mouse CD88 Phycoerythrin	BioLegend	135806	PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70)
Anti-mouse CD103 Allophycocyanin	eBioscience	17-1031-82	Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7)
Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450	eBioscience	48-0902-82	Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1)
Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin	eBioscience	17-1721-82	Anti-mouse CD172a APC (clone: P84)
Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421	BD Horizon	564188	BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488	eBioscience	53-3249-82	Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647	eBioscience	51-3249-82	Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1)
Glass Bottom Microwell Dishes 35mm petri dish, 14mm Microwell, No. 1.5 coverglass	MatTek Corperation	P35G-1.5-14-C
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	ThermoFisher Scientific	155411PK	Pack of 16
15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness	MatTek Corperation	PCS-1.5-15
Bare Platinum Wire	World Precision Instruments	PTP201	0.020" (0.5mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36934	Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use.
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free	Corning	356231
Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope	Carl Zeiss		Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss)
Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 objective lends	Carl Zeiss	420650-9901-000