Точность резки Мышь легких Кусочки визуализировать в прямом легочная дендритные клетки
Summary
Мы опишем способ генерации ограненных легких ломтиков (PCLS) и иммунным их визуализировать локализацию различных типов иммунных клеток в легких. Наш протокол может быть расширен, чтобы визуализировать расположение и функции различных типов клеток при различных условиях.
Abstract
Вдыхание аллергенов и патогенов вызывает множественные изменения в различных типах клеток иммунной системы в легких. Проточная цитометрия представляет собой мощный метод количественного анализа белков клеточной поверхности на иммунных клетках, но это не дает никакой информации о локализации и миграции моделей этих клеток в легких. Точно так же, хемотаксис анализы могут быть выполнены , чтобы изучить потенциал клеток реагировать на хемотаксис факторов в лабораторных условиях , но эти анализы не воспроизводят сложную среду интактного легкого. В отличии от этих вышеупомянутых методов, расположение отдельных типов клеток в легких может быть легко визуализирует путем генерирования ограненных легкие ломтиков (PCLS), окрашивая их с коммерчески доступными, флуоресцентно мечеными антителами, и визуализации разделов с помощью конфокальной микроскопии. PCLS может быть использован как для жизни и фиксированной легочной ткани, а срезы могут включать в себя области, как большой, как поперечное сечение всей доли, Мы использовали этот протокол, чтобы успешно визуализировать расположение самых разнообразных типов клеток в легких, в том числе различных типов дендритных клеток, макрофагов, нейтрофилов, Т-клеток и В-клеток, а также в качестве структурных элементов, таких как лимфатической, эндотелиальной и эпителиальные клетки. Способность визуализировать клеточные взаимодействия, такие как те, между дендритных клеток и Т-клеток, в живом, трехмерном легочной ткани, может показать, как клетки перемещаются в легких и взаимодействуют друг с другом в равновесном состоянии и во время воспаления. Таким образом, при использовании в сочетании с другими процедурами, такими как проточной цитометрии и количественной ПЦР, PCLS может способствовать всестороннему пониманию клеточных событий, которые лежат в основе аллергических и воспалительных заболеваний легких.
Introduction
После ингаляции провоспалительных стимулов, таких как липополисахарид (LPS), существует согласованное движение иммунных клеток в пределах, и из легких. Например, нейтрофилы быстро набраны в паренхиме легких и дыхательных путей. Кроме того, некоторые профессиональные антиген – представляющие клетки , известные как обычные дендритные клетки (CDCs) подвергаются относительно сложная модель миграции 1, 2. CDCs может быть идентифицирован с использованием проточной цитометрии, частично на основе их отображениях поверхностного маркера, CD11c. Четкие подмножества РС можно выделить с помощью дифференциальной поверхностной экспрессии CD103 и CD11b 3. После приобретения вдыхаемого антигена, некоторые CDCs выхода из легкого и мигрируют через лимфатические сосуды в легкое осушении лимфатических узлов (LNS) , где они представляют пептиды антиген-специфических Т – клеток 4. Это критическое раннее событие в инициации адаптивного иммунного гesponses. По неизвестным причинам, однако, не все ЦХБ, приобретающие ингаляционные антигены оставить легких, и многие из этих клеток остаются в этом органе в течение нескольких месяцев 5, 6. Это наблюдение может быть частично объяснено родословной развития этих клеток , поскольку моноцитов CD11c + клетки , лишенные рецептора хемокинов, CCR7, не могут мигрировать в региональных лимфоузлов 7, 8. Вполне вероятно, что миграция потенциал ЦХБ также определяется, по крайней мере, частично, по их анатомическому положению в легких. Однако точная локализация этих различных популяций ЦХБА в легком, характеризуется не полностью. Расширение знаний о локализации иммунных клеток в легких, а также молекул, которые направляют его, необходимо для лучшего понимания того, как иммунная система легкого становится активированной.
PCLS в настоящее время растетLY используется в качестве подхода экс виво для визуализации клеточного позиционирования и межклеточных взаимодействий, при сохранении структурной целостности архитектуры легких 9, 10. PCLS был использован для изучения легких многих видов, включая мышей, крупный рогатый скот, обезьяна, овца, лошадь и человек 11. Главным преимуществом этого метода является то, что приблизительно 20 ломтики могут быть получены из одной доли легкого мыши, тем самым уменьшая количество животных, необходимых для отдельных экспериментов. Практически все типы клеток иммунной системы, в том числе РСК, макрофагов, нейтрофилов и Т-клеток, присутствуют в PCLS и поддерживать свои нормальные структуры.
PCLS также может быть использована для изучения сигналов кальция и сократимости дыхательных путей и клеток гладких мышц после лечения с помощью ацетилхолина 12 или 13 метахолина. При таком подходе, лишь небольшая часть легких являетсяalyzed микроскопически, но одно исследование показало , что измерения сокращения дыхательных путей в PCLS изменяются только около 10% от среза , чтобы срез, и эта разница сравнима с таковым с использованием тестов функции легких у интактных животных 14. Другие исследователи использовали PCLS как экс виво подхода для изучения изменений в экспрессии цитокинов и поверхностных маркеров клеток после инкубации с LPS 15. PCLS также были использованы в качестве экс виво модели гипоксической легочной вазоконстрикции в небольших внутрикорпоративных ацинарной артерий. Эти сосуды расположены в той части легких , которые не могут быть достигнуты с использованием других процедур, в том числе записей из вскрытых артериальных сегментов или анализа субплеврально сосудов 16. Наша лаборатория в основном используется для визуализации PCLS локализации иммунных клеток в живой ткани легкого в устойчивом состоянии и следующую воспалительный стимулом в естественных условиях. Процедуры, которые мы разработали для этого следующие.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, был первоначально разработан для визуализации местоположения двух подмножеств ЦХБ в легких. Тем не менее, этот протокол может быть легко адаптирована для изучения различных типов клеток, сохраняя при этом жизнеспособность клеток и трехмерную архитектуру ле…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Джефф Такер, Эрика Скапини и Агнес Джаношази за помощь микроскопии, Лигон Перроу для ее управления колонии мыши и Джун Чэнь и Майкл Сандерсон за помощью ломтерезки ткани, и Майкл Фесслер и Дерек Каин для критического чтения рукопись. Эта работа финансировалась очного отделения NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09), который в свою очередь, при поддержке Департамента здравоохранения и социальных служб.
Materials
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 006617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35mm petri dish, 14mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
- Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
- Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).
- Sung, S. S., et al. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).
- Jakubzick, C., et al. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).
- Julia, V., et al. A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure. Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).
- Nakano, H., et al. Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage. Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).
- Nakano, H., et al. Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells. J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology. Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).
- Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).
- Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies. Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).
- Paddenberg, R., et al. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir Res. 7, 93 (2006).
- Wilson, R. H., et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).
- Schlitzer, A., et al. Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow. Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).
- Baluk, P., et al. Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation. Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).
- Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium. Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).
- Truman, L. A., et al. ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets. Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).
- Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
