Precisión de corte pulmón de ratón Rebanadas para visualizar las células en vivo pulmonar dendríticas
Summary
Se describe un método para generar la precisión de corte de pulmón rebanadas (PCLS) y la inmunotinción ellos para visualizar la localización de diversos tipos de células inmunes en el pulmón. Nuestro protocolo se puede extender a visualizar la ubicación y la función de muchos tipos celulares diferentes bajo una variedad de condiciones.
Abstract
La inhalación de alérgenos y patógenos provoca múltiples cambios en una variedad de tipos de células inmunes en el pulmón. La citometría de flujo es una técnica poderosa para el análisis cuantitativo de proteínas de superficie celular sobre las células inmunes, pero no proporciona información sobre los patrones de localización y migración de estas células dentro del pulmón. Del mismo modo, los ensayos de quimiotaxis se pueden realizar para estudiar el potencial de las células para responder a factores quimiotácticos in vitro, pero estos ensayos no reproducen el complejo entorno del pulmón intacto. En contraste con estas técnicas antes mencionadas, la ubicación de distintos tipos de células dentro del pulmón puede ser visualizado fácilmente mediante la generación de corte de precisión de pulmón rebanadas (PCLS), la tinción con anticuerpos disponibles comercialmente, marcado con fluorescencia, y la visualización de las secciones por microscopía confocal. PCLS se pueden utilizar tanto para vivir y fijan el tejido pulmonar, y las rodajas pueden abarcar áreas tan grandes como una sección transversal de un lóbulo completo. Hemos utilizado este protocolo para visualizar correctamente la localización de una amplia variedad de tipos de células en el pulmón, incluyendo distintos tipos de células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células T y células B, así como células estructurales tales como linfático, endotelial, y células epiteliales. La capacidad de visualizar las interacciones celulares, tales como las que existen entre las células dendríticas y las células T, en el tejido pulmonar en vivo, tridimensional, puede revelar cómo las células se mueven dentro del pulmón e interactúan uno con el otro en el estado estacionario y durante la inflamación. Por lo tanto, cuando se utiliza en combinación con otros procedimientos, como la citometría de flujo y la PCR cuantitativa, PCLS puede contribuir a una comprensión global de eventos celulares que subyacen en las enfermedades alérgicas e inflamatorias del pulmón.
Introduction
Tras la inhalación de los estímulos pro-inflamatorias tales como lipopolisacárido (LPS), hay un movimiento coordinado de las células inmunes en, dentro de, y desde el pulmón. Por ejemplo, los neutrófilos se reclutan rápidamente en el parénquima pulmonar y de las vías respiratorias. Además, algunas células presentadoras de antígeno profesionales conocidas como células dendríticas convencionales (CDC) se someten a un patrón de migración relativamente complejo 1, 2. CDC se pueden identificar utilizando la citometría de flujo, basadas en parte en su pantalla del marcador de la superficie, CD11c. Subconjuntos distintos de DCs se pueden distinguir por la expresión en la superficie diferencial de CD103 y CD11b 3. Al adquirir antígeno inhalado, algunos CDCs salen del pulmón y migran a través de los vasos linfáticos a los nodos linfáticos pulmonares de drenaje (LNS) donde presentan péptidos de antígeno específico de células T 4. Este es un evento temprano crítico en la iniciación de r inmune adaptativaesponses. Por razones desconocidas, sin embargo, no todos los CDCs que adquieren antígenos inhalados salen del pulmón, y muchas de estas células permanecen en ese órgano durante varios meses 5, 6. Esta observación puede explicarse en parte por la ascendencia de desarrollo de estas células porque CD11c derivadas de monocitos + células que carecen del receptor de quimioquinas, CCR7, son incapaces de migrar a los LN regionales 7, 8. Parece probable que el potencial de migración de los CDC también está determinada, al menos en parte, por su posición anatómica dentro del pulmón. Sin embargo, la localización precisa de estas diferentes poblaciones de CDC en el pulmón no se caracteriza completamente. Un mejor conocimiento de la localización de las células inmunes en el pulmón, y de las moléculas que lo dirigen, es necesaria para una mejor comprensión de cómo se activa el sistema inmunológico del pulmón.
PCLS se están aumentandoly utiliza como un enfoque ex vivo para visualizar posicionamiento celular y interacciones célula-célula, mientras se mantiene la integridad estructural de la arquitectura pulmonar 9, 10. PCLS se han utilizado para estudiar los pulmones de muchas especies, incluyendo ratones, vacas, monos, ovejas, caballos y seres humanos 11. Una ventaja principal de esta técnica es que aproximadamente 20 rebanadas se pueden preparar a partir de un único lóbulo de un pulmón de ratón, lo que reduce el número de animales necesarios para los experimentos individuales. Prácticamente todos los tipos de células inmunes, incluyendo DCs, macrófagos, neutrófilos y células T, están presentes en PCLS y mantener sus estructuras normales.
PCLS también se puede utilizar para estudiar la señalización del calcio y de la contractilidad de las células de las vías respiratorias y el músculo liso después del tratamiento con la acetilcolina 12 o metacolina 13. En este enfoque, sólo una pequeña porción del pulmón es unaalyzed microscópicamente, pero un estudio informó que las mediciones de contracción de las vías respiratorias en PCLS varían sólo alrededor del 10% a partir de la rebanada de cortar, y esta variación es comparable a la observada usando pruebas de función pulmonar en animales intactos 14. Otros investigadores han utilizado PCLS como un enfoque ex vivo para estudiar los cambios en la expresión de citocinas y marcadores de la superficie celular después de la incubación con LPS 15. PCLS también se han utilizado en un modelo ex vivo de la vasoconstricción pulmonar hipóxica en pequeñas arterias intra-acinares. Estos vasos se encuentran en la parte del pulmón que no puede ser alcanzado mediante otros procedimientos, incluyendo las grabaciones de segmentos o análisis de los vasos subpleurales 16 arteriales diseccionados. Nuestro laboratorio ha utilizado principalmente PCLS para visualizar la localización de células inmunes en el tejido pulmonar en vivo en estado estacionario, y tras un estímulo inflamatorio in vivo. Los procedimientos que hemos desarrollado para esto son las siguientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí fue desarrollado originalmente para visualizar las ubicaciones de dos subconjuntos de CDC dentro del pulmón. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar muchos tipos de células diferentes, mientras que el mantenimiento de la viabilidad celular y la arquitectura tridimensional de los pulmones. Esta última característica es una ventaja importante sobre los sistemas de cultivo celular y facilita la identificación de tipos de células raras. El método se basa en l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Jeff Tucker, Erica Scappini, y Agnes Janoshazi por su ayuda con la microscopía, Ligon Perrow por su gestión de la colonia de ratones, y Jun Chen y Michael Sanderson para obtener ayuda con la máquina de cortar el tejido, y Michael Fessler y Derek Cain para la lectura crítica el manuscrito. Este trabajo fue financiado por la rama intramural del NIEHS, NIH (Zia ES102025-09), que a su vez está patrocinado por el Departamento de Salud y Servicios Humanos.
Materials
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 006617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35mm petri dish, 14mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
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