Hassas kesimli Canlı Pulmoner Dendritik Hücreler Visualize'a Fare Akciğer Dilimleri
Summary
Bu hassas kesim Akciğer dilimleri (PCLS) üretilmesi ve akciğerde çeşitli immün hücre tipleri lokalizasyonunu görselleştirmek için bunları immünolojik boyama için bir yöntem tarif eder. Bizim protokol, çeşitli koşullar altında konum ve birçok farklı hücre tiplerinin fonksiyonunu görselleştirmek için uzatılabilir.
Abstract
alerjenler ve patojenlerin solunması akciğer immün hücre tiplerinde çeşitli birden çok değişiklik ortaya çıkarmaktadır. Akış sitometrisi bağışıklık hücreleri üzerinde hücre yüzey proteinlerinin kantitatif analizi için güçlü bir tekniktir, ancak bu akciğer içinde, bu hücrelerin lokalizasyonunda ve göç desen hakkında bilgi vermez. Benzer şekilde, kemotaksi deneyleri, in vitro olarak kemotaktik faktörlere yanıt hücrelerinin değişim potansiyelini araştırmak için yapılabilir, ancak bu deneyler, sağlam akciğer kompleks ortam yeniden yoktur. Bu yukarıda sözü edilen tekniklerin aksine, akciğer içinde tek tek hücre tiplerinde konumu hali hazırda ticari olarak temin edilebilir, flüoresan etiketli antikorlar ile boyanması, hassas-kesim Akciğer dilimleri (PCLS) üretilmesi ve konfokal mikroskopi ile bölümleri görselleştirme ile görselleştirilebilir. PCLS canlı her ikisi için kullanılan ve akciğer dokusunun sabit ve dilimler bütün bir lob kesiti kadar büyük alanları kapsayabilir edilebilir. Başarıyla dendritik hücrelerin farklı tipleri, makrofajlar, nötrofiller, T hücreleri ve B hücreleri gibi, örneğin lenfatik endotelyal gibi yapısal hücreleri dahil olmak üzere akciğerde hücre tipleri, çeşitli konumunu görselleştirmek için bu protokolü kullanılır, ve adres epitel hücreleri. Hücreler akciğer içinde hareket etmesi ve kararlı bir halde ve enflamasyon sırasında birbirleri ile nasıl etkileşime, canlı, üç boyutlu akciğer dokusunda dendritik hücreleri ve T hücreleri arasındaki gibi hücresel etkileşimler, görselleştirmek için yeteneği, ortaya çıkarabilir. gibi akış sitometrisi ve kantitatif PCR gibi başka prosedürler ile bir arada kullanıldığında Böylece, PCLS akciğerin allerjik ve enflamatuar hastalıkların altında yatan hücresel etkinlikleri kapsamlı bir anlayış katkıda bulunabilir.
Introduction
Bu tür lipopolisakarit (LPS) gibi pro-enflamatuar uyarılara solunması sonra, orada içinde, bağışık hücrelerin koordineli hareketi ve akciğer. Örneğin, nötrofiller hızla akciğer parankimi ve hava yoluna alınsın. Buna ek olarak, geleneksel bir dendritik hücreler (CDCS) olarak bilinen bir profesyonel antijen sunan hücreler, nispeten karmaşık göç desen, 1, 2 geçer. CDCS yüzey işaretleyici, kendi ekranında CD11c kısmen, akış sitometrisi kullanılarak tespit dayalı olabilir. DClerin Farklı alt-kümeleri CD103 ve CD11b 3 ayırıcı yüzey ifadesi ile ayırt edilebilir. Nefes yoluyla antijene aldıktan sonra, bir CDCS akciğer çıkmak ve antijen-spesifik T hücrelerinin 4 peptidleri sunan akciğer lenf düğümleri (LN) lenf damarları içinden yer değiştirmektedir. Bu adaptif bağışıklık r başlatılmasında kritik bir erken olaydıresponses. Bilinmeyen nedenlerden dolayı, ancak, inhale antijenleri elde tüm CDCS akciğere bırakmaz ve bu hücrelerin çoğunun, birkaç ay 5 için bu organda 6 kalır. Monosit türevli CD11c + kemokin reseptörü, CCR7 yoksun hücreler, bölgesel LN 7, 8 göç etmek mümkün olduğu için bu gözlem, bu hücrelerin gelişim kökenli ile açıklanabilir. CDCS göç potansiyeli de akciğer içindeki anatomik pozisyona göre, en azından kısmen, tespit edilir gibi görünmektedir. Bununla birlikte, akciğerdeki CDCS bu farklı popülasyonlarda kesin yeri tam olarak karakterize edilmemiştir. Akciğer içinde ve yöneltmek moleküllerin bağışıklık hücre lokalizasyonu iyileştirilmiş bir bilgi, akciğerin bağışıklık sistemi aktive olur nasıl daha iyi anlamak için gereklidir.
PCLS olmak artıyorakciğer yapısının 9, 10 yapısal bütünlüğünü korurken, ly, hücresel konum ve hücre-hücre etkileşimleri görselleştirmek için bir eks vivo yaklaşımı olarak da kullanılır. PCLS fareler, sığır, maymun, koyun, at, ve insanlar 11 dahil olmak üzere birçok türün, akciğerlerini incelemek için kullanılmıştır. Bu tekniğin önemli bir avantajı, yaklaşık 20 dilim böylece ayrı ayrı deneyler için gerekli hayvan sayısını azaltmak, bir fare akciğer Tek bir lobdan elde hazırlanabilir olmasıdır. DCler, makrofajlar, nötrofiller ve T hücreleri dahil olmak üzere hemen hemen tüm immün hücre tipleri, PCLS içinde mevcut olan ve normal yapısını korur.
PCLS de asetilkolin 12 veya metakolin 13 ile tedaviden sonra, kalsiyum sinyal ve solunum yolu düz kas hücrelerinin kasılma incelemek için kullanılabilir. Bu yaklaşımda, akciğer sadece küçük bir kısmı, birmikroskobik alyzed ancak bir çalışma PCLS hava yolu daralması ölçümleri dilim dilim sadece yaklaşık% 10 farklılık gösterir ve bu varyans intakt hayvanlarda 14 akciğer fonksiyon testleri kullanılarak görülenle kıyaslanabilir olduğunu bildirdi. Diğer araştırmacılar, LPS 15 ile inkübe edildikten sonra, sitokin ekspresyon ve hücre yüzey markörlerinin değişiklikleri incelemek için bir eks vivo yaklaşımı olarak PCLS kullandık. PCLS aynı zamanda küçük içi asinar arterlerde pulmoner hipoksik vazokonstriksiyon bir ex vivo modelinde kullanılmıştır. Bu damarlar kesilmiş arter segmentler veya kalmanın damar 16 analizinden kayıtları gibi diğer prosedürler, ulaşılamıyor akciğer kısmında yer almaktadır. Bizim laboratuvar öncelikle bir in vivo ateşli güdünün ardından bağışıklık hücresi kalıcı halde canlı akciğer dokusunda lokalize edilmesini ve görselleştirmek için PCLS kullanmıştır. aşağıdaki gibi biz bunun için geliştirdik yöntemlerdir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol başlangıçta akciğer içinde CDCS iki alt kümelerinin yerleri görselleştirmek için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu protokol, hali hazırda hücre canlılığı ve akciğer üç-boyutlu yapısını muhafaza ederken, bir çok farklı hücre tipleri incelemek için adapte edilebilir. İkinci özellik hücre kültürü sistemleri üzerinden önemli bir avantaj olduğunu ve nadir hücre tiplerinin tanımlanması kolaylaştırır. yöntem, akciğer PCLS oluşturulmasına dayanır ve…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz mikroskobu ile yardım için Jeff Tucker, Erica Scappini ve Agnes Janoshazi ederim, eleştirel okuma fare kolonisinin onun yönetimi için Ligon Perrow ve Jun Chen ve Michael Sanderson doku dilimleme makinesi ile yardım ve Michael Fessler ve Derek Cain el yazması. Bu çalışma da Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı tarafından desteklenmektedir NIEHS, NIH (Zia ES102025-09), intramural dalı tarafından finanse edildi.
Materials
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 006617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35mm petri dish, 14mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
- Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
- Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).
- Sung, S. S., et al. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).
- Jakubzick, C., et al. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).
- Julia, V., et al. A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure. Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).
- Nakano, H., et al. Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage. Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).
- Nakano, H., et al. Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells. J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology. Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).
- Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).
- Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies. Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).
- Paddenberg, R., et al. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir Res. 7, 93 (2006).
- Wilson, R. H., et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).
- Schlitzer, A., et al. Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow. Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).
- Baluk, P., et al. Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation. Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).
- Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium. Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).
- Truman, L. A., et al. ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets. Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).
- Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
