Precision-kutt Mouse Lung Slices å visualisere Live-lunge dendrittiske celler

Summary

Vi beskriver en fremgangsmåte for å generere Precision snitt Lung Skiver (PCLS) og farging dem for å visualisere lokaliseringen av forskjellige immuncelletyper i lungen. Vår Protokollen kan utvides for å visualisere plasseringen og funksjonen av mange forskjellige celletyper under en rekke forskjellige forhold.

Abstract

Innånding av allergener og patogener fremkaller flere forandringer i en rekke av immuncelletyper i lungen. Strømningscytometri er en kraftfull teknikk for kvantitativ analyse av celleoverflateproteiner på immunceller, men det gir ingen informasjon om lokalisering og vandringsmønstrene av disse celler i lungene. På samme måte kan kjemotaksis analysen utføres for å studere mulighetene for cellene til å svare på kjemotaktiske faktorer in vitro, men disse analysene ikke reprodusere det komplekse miljø av det intakte lunge. I motsetning til disse nevnte metoder, kan plasseringen av de enkelte celletyper i lungene blir lett visualisert ved å generere Precision snitt Lung Skiver (PCLS), farging dem med kommersielt tilgjengelige, fluorescensmerket antistoff, og visualisering av seksjonene ved hjelp av konfokal mikroskopi. PCLS kan brukes for både direkte og fast lungevev, og skivene kan omfatte områder som stort som et tverrsnitt av en hel lobe. Vi har brukt denne protokollen for å kunne visualisere plasseringen av et stort utvalg av celletyper i lungen, inkludert forskjellige typer dendrittiske celler, makrofager, neutrofiler, T-celler og B-celler, så vel som strukturelle celler slik som lymfe, endotel, og epitelceller. Evnen til å visualisere cellulære interaksjoner, for eksempel de som er mellom dendrittiske celler og T-celler i levende, tredimensjonal lungevev kan avsløre hvordan celler bevege seg i lunge og kommuniserer med hverandre ved likevekt og ved betennelse. Således, når det brukes i kombinasjon med andre fremgangsmåter, slik som strømningscytometri og kvantitativ PCR, kan PCLS bidra til en omfattende forståelse av cellulære hendelser som ligger til grunn allergiske og inflammatoriske sykdommer i lungen.

Introduction

Etter inhalering av pro-inflammatoriske stimuli så som lipopolysakkarid (LPS), er det en koordinert bevegelse av immunceller inn i, innenfor og fra lungen. For eksempel er nøytrofile hurtig rekruttert til lunge parenchyma og luftveier. I tillegg er noen profesjonell antigenpresenterende celler som er kjent som konvensjonell dendrittiske celler (CDCS) gjennomgå en forholdsvis komplisert migrasjonsmønster ^{1, 2.} CDCS kan identifiseres ved hjelp av flow cytometri, delvis basert på deres visning av de overflatemarkør, CD11c. Distinkte undergrupper av DC kan skilles ved differensial overflateekspresjon av CD103 og CD11b ^3. Ved å anskaffe inhalert antigen, noen CDCS avslutte lunge og migrere gjennom lymfekarene til lunge-drenerende lymfeknuter (LNS) hvor de presenterer peptider til antigen-spesifikke T-celler ^4. Dette er en kritisk tidlig begivenhet i initiering av adaptive immun responses. Av ukjente grunner, men ikke alle kabelfordelingsskap som skaffer inhalerte antigener forlater lunge, og mange av disse cellene forblir i det organ i flere måneder ^{5, 6.} Denne observasjonen kan delvis forklares ved den utviklingsmessige opphav til disse cellene, fordi monocytt-avledede CD11c ⁺ celler som mangler kjemokinreseptoren, CCR7, er ute av stand til å migrere til regionale LNS ^{7, 8.} Det synes sannsynlig at migreringen potensialet i kabelfordelingsskap bestemmes også, i det minste delvis, ved sin anatomisk stilling i lungene. Imidlertid er den nøyaktige lokalisering av disse forskjellige populasjoner av kabelfordelingsskap i lungen ikke fullstendig karakterisert. En forbedret kunnskap om immunceller lokalisering i lungen, og av de molekyler som styrer det, er nødvendig for en bedre forståelse av hvordan immunsystemet til lungen blir aktivert.

PCLS blir stadigly brukt som en ex vivo-metode for å visualisere mobilposisjonerings og celle-celleinteraksjoner, og samtidig opprettholde den strukturelle integriteten til lungen arkitekturen ^{9, 10.} PCLS har blitt brukt til å studere lungene av mange arter, inkludert mus, storfe, aper, sauer, hester og mennesker ^11. En stor fordel med denne teknikken er at omtrent 20 skiver kan fremstilles fra en enkelt lapp av en mus lunge, og dermed redusere antall dyr er nødvendig for individuelle eksperimenter. Praktisk talt alle immune celletyper, inkludert DCS, makrofager, nøytrofiler og T-celler, er til stede i PCLS og opprettholde sin normale strukturer.

PCLS kan også brukes til å studere kalsiumsignalisering og kontraktilitet av luftveis og glatte muskelceller etter behandling med acetylcholin ¹² eller metakolin ^13. Ved denne metode bare en liten del av lungen er enalyzed mikroskopisk, men en undersøkelse rapporterte at måling av luftveistrekningen i PCLS variere bare omtrent 10% fra skive til skive, og denne variasjonen er sammenlignbart med det som ses ved hjelp av lungefunksjonstester i intakte dyr ^14. Andre forskere har brukt PCLS som en ex vivo-metode for å studere forandringer i cytokinekspresjon og celleoverflatemarkører etter inkubasjon med LPS ^15. PCLS har også vært anvendt i en ex vivo-modell av hypoksisk pulmonær vasokonstriksjon i små intra-acinar arterier. Disse fartøyene er plassert i den del av lungen som ikke kan nås ved hjelp av andre fremgangsmåter, inkludert opptak fra dissekerte arterielle segmenter eller analyse av subpleural fartøy ^16. Vårt laboratorium har først og fremst brukes til å visualisere PCLS immunceller lokalisering i levende lungevev ved stabil tilstand, og etter en in vivo-inflammatorisk stimulus. Prosedyrene vi har utviklet for dette er som følger.

Protocol

Animal eksperimentelle prosedyrer som er beskrevet i denne artikkelen ble godkjent av NIEHS Animal Care og bruk Committee (IACUC). 1. Fremstilling Lung Hus mus mellom 6 og 12 ukers alder i patogenfrie forhold i henhold til retningslinjer gitt av Institutional Animal Care og bruk komiteer. MERK: avbildes mus kan være enten naive eller behandlet, avhengig av hver forskerens interesser. Her beskriver vi immune celle lokalisering i naive mus og hos mus behandlet med 100 ug ova…

Representative Results

For å identifisere plasseringen av to likestrøms undergrupper, CD11 hi kabelfordelingsskap og CD103 + CDCS, PCLS fra C57BL / 6-mus ble kuttet og farget med monoklonale antistoffer (mAbs) som er spesifikke for CD11c, CD88, CD103, CD324 og (E-cadherin). Antistoffer mot CD324 flekk luftveisepitelceller og CD88 vises på makrofager og nøytrofiler, men ikke CDCS 8. Dette tillot oss å skille kabelfordelingsskap fra CD11c + makrofager…

Discussion

Protokollen er beskrevet her ble opprinnelig utviklet for å visualisere plasseringen av to undergrupper av kabelfordelingsskap i lungene. Imidlertid kan denne protokollen lett tilpasses for å studere mange forskjellige celletyper, og samtidig opprettholde cellenes levedyktighet og den tredimensjonale arkitektur av lungen. Sistnevnte trekk er en viktig fordel i forhold til cellekultursystemer, og muliggjør identifikasjon av sjeldne celletyper. Metoden bygger på generering av PCLS fra lungen, og en passende kombinasjo…

Materials

C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	000664
Prox1-TdTomato transgenic mice	Jackson Laboratory	018128	B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J
OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice	Jackson Laboratory	004194, 006617	B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J
Rag1 knock-out mice	Jackson Laboratory	002216	B6.129S7-Rag1tm1Mom/J
Ovalbumin, Low Endo, Purified	Worthington Biochemical Corporation	LS003059
Lipopolysaccharides from Escherichia coli	Sigma-Aldrich Co.	L2630-25MG
Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft	BD Diagnostic Systems	427421	0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter
GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose	BioExpress	E-3112-125	2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C.
Compresstome VF-300	Precisionary Instruments, Inc.	VF-300
Double Edge Stainless Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	72000	Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung.
Krazy Glue All Purpose Instant Gel	VWR	500033-484	Commonly available for $3/tube in local drugstores
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	ThermoFisher Scientific	21083027
Normal Rat Serum	Jackson ImmunoResearch Inc.	012-000-120
Normal Mouse Serum	Jackson ImmunoResearch Inc.	015-000-120
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30071.03HI
Staining Buffer	Made in House	N/A	PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4
Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies)	Made in House	N/A	Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2
Anti-mouse CD11b eFluor 450	eBioscience	48-0112-80	Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70)
Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605	BioLegend	101237	Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70)
Anti-mouse CD11c Phycoerythrin	eBioscience	12-0114-82	PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418)
Anti-mouse CD11c Allophycocyanin	BD Phamingen	550261	APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3)
Anti-mouse CD88 Phycoerythrin	BioLegend	135806	PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70)
Anti-mouse CD103 Allophycocyanin	eBioscience	17-1031-82	Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7)
Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450	eBioscience	48-0902-82	Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1)
Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin	eBioscience	17-1721-82	Anti-mouse CD172a APC (clone: P84)
Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421	BD Horizon	564188	BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488	eBioscience	53-3249-82	Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647	eBioscience	51-3249-82	Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1)
Glass Bottom Microwell Dishes 35mm petri dish, 14mm Microwell, No. 1.5 coverglass	MatTek Corperation	P35G-1.5-14-C
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	ThermoFisher Scientific	155411PK	Pack of 16
15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness	MatTek Corperation	PCS-1.5-15
Bare Platinum Wire	World Precision Instruments	PTP201	0.020" (0.5mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36934	Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use.
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free	Corning	356231
Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope	Carl Zeiss		Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss)
Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 objective lends	Carl Zeiss	420650-9901-000