Используя pHluorin-маркированные Рецепторы для мониторинга субклеточных локализации и торговли
Summary
Пометка внеклеточный домен мембранного белка с рН-чувствительного флуорофора, superecliptic pHluorin (SEP), позволяет внутриклеточной локализации, выражение, и незаконный оборот подлежит определению. Визуализации SEP-меченых белков с полным внутренним отражением флуоресцентной микроскопии (TIRFM) позволяет количественно оценить уровни белка в периферической ER и плазматической мембраны.
Abstract
Понимание мембраны незаконный оборот белков, сборка и выражение требует такого подхода, который проводит различие между теми, кто живет в внутриклеточных органелл и те, локализованные на плазматической мембране. Традиционные измерения флуоресценции на основе не имеют способность различать мембранных белков, проживающих в разных органеллах. Режущий край методологии выходят за рамки традиционных методов путем сочетания рН-чувствительных флуорофоров с общей микроскопии внутреннее отражение флуоресценции (TIRFM). TIRF освещение возбуждает образец до примерно 150 нм от поверхности раздела стекла и образца, что приводит к снижению фона, увеличивая отношение сигнала к шуму, и повышение разрешения. Объем возбуждения в TIRFM включает плазматическую мембрану и близлежащие органеллы, такие как периферийное ER. Superecliptic pHluorin (SEP) является рН чувствительной версия GFP. Генетически кодирующий SEP в внеклеточный домен мембранного белка, представляющего интерес позиционирует флуорофор наполостную сторона ER и во внеклеточной области клетки. СВП флуоресцентный при рН больше 6, но остается в выключенном состоянии при более низких значениях рН. Таким образом, рецепторы с тэгом SEP флуоресцировать, когда они проживали в эндоплазматический ретикулум (ER) или при введении в плазматической мембране (ПМ), но не тогда, когда ограничивается везикулы людьми или других органеллах, таких как Гольджи. Внеклеточный рН можно регулировать, чтобы диктовать флуоресценцию рецепторов на плазматической мембране. Различие в флуоресценции между TIRF изображений в нейтральной и кислой внеклеточный рН в той же самой клетке соответствует относительному числу рецепторов на плазматической мембране. Это позволяет одновременное измерение внутриклеточной и плазменных мембранных рецепторов резидентов. Одно вставки пузырек события также могут быть измерены, когда внеклеточный рН нейтральна, что соответствует низким везикулы оборота рН сплавленных с плазматической мембраной и перехода в флуоресцентное состояние. Это Versatilе метод может быть использован для изучения локализации, экспрессии и торговлей мембранных белков.
Introduction
Изменения в экспрессии рецепторов, распределения и сборки были связаны с широким спектром заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, кистозного фиброза и наркомании 1, 2, 3, 4, 5. Например, никотин и другие никотиновые лиганды влияют на торговлю никотиновых рецепторов ацетилхолина (nAChRs) , что приводит к изменениям в области незаконного оборота, выражения и повышающей регуляцией 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Никотин увеличивает общее количество собранных nAChRs внутри клетки, повышает оборотом к плазматической мембране, А.Н.d изменяет сборку субъединиц в пользу высокой чувствительности версии некоторых подтипов. Решение различных изменений в области незаконного оборота, собраний и экспрессии рецепторов в модели болезни обеспечивает важные механистические детали, которые необходимы для определения целевых наркотиков. Идеальный подход позволил бы быстро проводить различие между внутриклеточными рецепторами и те, локализованный на плазматической мембране. Это особенно сложно в тех случаях, когда большинство конкретного белка проживает внутриклеточно, например, с помощью nAChRs. Поскольку большинство nAChRs локализованы в эндоплазматической сети, традиционные измерения не имеют пространственно-временное разрешение, необходимое для локализации точно определить и незаконного оборота изменений вдоль секреторного пути. Исследования торговли людьми Рецептор и экспрессия nAChRs были в первую очередь были проведены с использованием связывания радиолиганда 11, биотинилирования анализы 12, Вестерн – блоттинга 13 или иммунопреципитация Techniq 12 жает. Это зависит от специфичности связывания с молекулой-репортером или фиксации клеток и не имеют возможности одновременно различать между жителем плазматической мембраны и внутриклеточных рецепторов. Таким образом, исследования сборки ионных каналов и везикул динамика во многом полагались на низкой пропускной способности электрофизиологических методов 14.
Улучшенный пространственное и временное разрешение можно с прогрессом в области флуоресцентной микроскопии. Генетически кодируемые репортерные молекулы, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его вариантов, устранить неспецифическое связывание проблем и повышения чувствительности 15. РН – чувствительного вариант GFP, известный как superecliptic pHluorin (SEP), могут быть использованы , чтобы использовать врожденные различия рН между отсеками внутри ячейки , чтобы определить локализацию 5, 7, 8,Ссылка "> 9, 16, 17, 18. сентября флуоресцирует при рН выше 6, но остается в выключенном состоянии при более низком рН. Таким образом, рецепторы с тэгом SEP на их полостной стороне обнаруживаются , когда присутствует в эндоплазматический ретикулум ( ER), или при введении в плазматической мембране (ПМ), но не тогда, когда прикован к пузырьку оборота. манипуляции с внеклеточным рН в контакте с рецепторами на плазматической мембране, следовательно, приводит к изменению флуоресценции и, следовательно, обнаружение этих рецепторов. Если в той же клетке последовательно изображается как при нейтральном внеклеточного рН , а затем рН ниже 6, разница между изображениями приписывается рецепторы , расположенные на плазматической мембране. Это позволяет одновременное измерение внутриклеточной (периферический ER) и рецепторов мембранного резидентные плазмы 5, 7, 8 </suр>, 9. Single вставки пузырек события также могут быть разрешены, когда внеклеточный рН является нейтральным. После того, как низкий везикул оборот рН сливается с плазматической мембраной, полостную часть везикулы подвергается нейтральной внеклеточный раствор, вызывая переход детектируется как взрыв флуоресценции 7, 18, 19, 20. Сентябрем позволяет измерять рецепторами , локализованными на плазменной мембране и периферической эндоплазматической сети, а также предоставляет средства для измерения оборота рецепторов между этими субклеточных областей 5, 7, 18.
Для достижения более высокого разрешения на мембране, рецептор с SEP генетически закодированы визуализируется с помощью полного внутреннего отражения микроскопии (цветения TIRFM). Этот метод особеннополезно, если большинство рецепторов локализованы в внутриклеточных областей, так как TIRFM увеличивает видимость плазматической мембраны. TIRFM также позволяет разрешение динамики незаконного оборота одиночных везикул, несущих SEP-меченых рецепторов при введении в ПМ. Полное внутреннее отражение происходит на границе раздела материалов с различными показателями преломления, например, между клеткой и стеклянной крышкой скольжения 21, 22. Сентября флуоресцирует при облучении 488 нм возбуждение, которое ориентировано на достижение полного внутреннего отражения на границе раздела стекла и клеточного раствора. Это производит мимолетную волну, которая проникает примерно 150 нм в образце, только возбуждающих флуорофоров в пределах этого объема. Только Сентябрю рецепторов, содержащих в нейтральной среде рН в указанном диапазоне возбуждения обнаружены, соответствующие тем, которые постоянно находящиеся на плазматической мембране или периферической эндоплазматический ретикулум. Поскольку обнаружение ограничено то возбуждении затухающих волн, фоновой флуоресценции из внутриклеточного области уменьшается , а соотношение сигнал – шум увеличивается 21, 22. Кроме того, поскольку излучение не проникает большую часть клетки, фотоповреждение сведено к минимуму, что позволяет получение изображений живых клеток по сравнению с течением времени. В результате, TIRFM в сочетании с генетически кодируемых Сентябрю обеспечивает высокое разрешение и чувствительность, необходимую для измерения внутриклеточную локализацию и торговлей динамики мембранных рецепторов вдоль секреторного пути.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чувствительность рН SEP позволяет рецепторы , находящиеся на плазматической мембране , следует отличать от внутриклеточных рецепторов в эндоплазматической сети, и он может быть использован для разрешения вставки событий Рецептор несущих везикулы 5, 7,<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the National Institute on Drug Abuse T32 DA 016176, National Institute on Drug Abuse DA 038817, and National Institute on Drug Abuse DA 040047.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2 | VWR | 82050-856 | |
| 35 mm glass bottom petri dishes, sterile | Cell E&G | GBD00002-200 | |
| Poly-D-lysine | vwr | 215017510 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Fisher Scientific | 11-965-084 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco / Fisher Scientific | 31-985-088 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered) | Gibco / Fisher Scientific | 16-000-044 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Fisher Scientific | 12604-021 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | VWR | 45000-652 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco / Fisher Scientific | 21083027 | Optional |
| Lipofectamine | Fisher Scientific | 11668030 | Gently mix; Do not vortex |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-10 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Objective immersion oil | Olympus | Type F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 60x, 1.49 NA oil immersion objective | Olympus | APON 60XOTIRF | |
| Motorized stage | Prior | IXPROXY | |
| Motorized actuator (stepper motor) | Thorlabs | ZST213 | |
| MetaMorph (or other imaging program) | Metamorph | ||
| 488 nm laser | Market Tech | ||
| Single mode fiber | Thorlabs | SM450 | |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E01 | |
| Dichroic 488 nm LP | Semrock | Di02-R488-25×36 | |
| Bandpass filter, 488 nm | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Bandpass filter, 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 |
References
- Lester, H. A., et al. Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery. AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).
- Henderson, B. J., Lester, H. A. Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs. Neuropharmacology. 96 (Pt B), 178-193 (2015).
- Banerjee, C., et al. Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer’s and Parkinson’s disease–a stereological approach. Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).
- Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. Cortical α7 nicotinic acetylcholine receptor and β-amyloid levels in early alzheimer disease. Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors. Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).
- Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).
- Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. Endocytic trafficking of CFTR in health and disease. J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).
- Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels. J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).
- Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms. J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).
- Mazzo, F., et al. Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor. J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).
- Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. α4β2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine. Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I., Ming, L. . Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. 117, (2016).
- Khiroug, S. S., et al. Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique. BMC Neurosci. 10 (141), (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).
- Yudowski, G. A., et al. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).
- Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation. Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).
