Brug af en helmonteret immunhistokemisk metode til at studere indervation af galdevejen i<em> Suncus murinus</em
Summary
En helmonteret immunohistokemisk tilgang til at visualisere neurofilamentproteinekspression i det ekstrahepatiske galde i Suncus murinus. Er præsenteret her. Denne protokol kan bruges til at analysere innerveringen af alle viscerale organer i S. murinus eller andre arter.
Abstract
Dette arbejde beskriver detaljeret immunhistokemisk farvningsmetode i detaljer ved anvendelse af neurofilamentproteinantistof til at mærke innervation af galdevejen i Suncus murinus ( S. murinus ). Først blev prøven dissekeret fra S. murinus og fikseret i 4% paraformaldehyd (PFA). For det andet blev en enzymatisk behandling og potentiel endogen peroxidase inaktivering udført. Prøven blev derefter udsat for det primære antistof, anti-neurofilament protein antistof i 3-6 dage. Det blev derefter inkuberet med det sekundære antistof konjugeret med peberrodperoxidase. Farvereaktionen blev afsløret ved at reagere prøven med et 3,3'-diaminobenzidin (DAB) substrat. Denne metode kan anvendes til at analysere innerveringen af alle organer. Desuden kan denne protokol også tilpasses til at teste andre neuronale antistoffer, men optimering af antibodiesDet skal først gøres. Denne metode blev oprindeligt indført af Kuratani og Tanaka 1 , 2 , 3 .
Introduction
Husets muskeskrue , Suncus murinus , tilhører ordren Insectivora og familien Soricidae. Dette lille pattedyr er fordelt i hele Sydøstasien og beboer huse og græsarealer, der ligger tæt på menneskelige boliger eller kvægpinde 4 . Denne art udviser generelle morfologiske egenskaber mere ligner mennesker end andre laboratoriedyr, såsom musen, rotten og kaninen 5 . Tidligere blev helbredsimmunfarvning med en perifer neuronmarkør for S. murinus neurofilamentprotein (NFP) brugt til at mærke perifere nerver i bugspytkirtlen 6 , major duodenal papilla 7 , pylorus 8 , galdeblære 5 og ekstrahepatisk galdeveje 9 .
NFP er et makromolekylært kompleks, som er en del af det modne neuronale cytoskelet. Neurofilament-relateret proteinS formidle interaktioner mellem NFP og zygosomet. Både enzymfunktionen og strukturen af linkerproteiner reguleres af NFP 10 . NFP-komplekset er fremstillet af tre polypeptider: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) og NF-H (200 kDa). NFP kan findes i neuronale axoner i både det centrale og perifere nervesystem. Anti-humant NFP antistof har vist sig at mærke axoner i det centrale og perifere nervesystem. Anatomiske og elektrofysiologiske undersøgelser har vist, at sphincter, galdeblære og proksimal mave-tarmkanalen er forbundet 11 , 12 , 13 , 14 . Imidlertid er de morfologiske egenskaber ved deres neuronale forbindelser endnu ikke defineret.
Dette arbejde demonstrerer anvendelsen af en helmonteret immunohistokemisk farvningsmetode til at mærke innerveringen af S. murinus bilIarytisk kanal med et NFP antistof.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette værk beskriver den eksperimentelle procedure til visualisering af det ekstrahepatiske galdevejs indervering ved anvendelse af et antistof mod neurofilamentprotein. Denne protokol blev tilpasset fra protokollen beskrevet af Kuratani og Tanaka 1 , 2 , 3 .
For dette eksperiment skal du planlægge tidslinjen for hver af eksperimenterne, da hele monteringsfarvningen går videre i 2-3 uger. Skibet,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne har ingen anerkendelser.
Materials
| orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
| papain | Wako | 164-00172 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Wako | 010-15131 | |
| sodium azide | Nacalai Tesque | 312-33 | |
| neurofilament protein (NFP) antibody | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
| peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Wako | 349-00903 | |
| imidazole | Sigma | I-0125 |
References
- Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method. Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung. Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of avian trigeminal nerves. Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).
- Yi, S. Q., et al. House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model. Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy. World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).
- Yi, S. Q., et al. Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures. Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy. World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).
- Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study. Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).
- Wang, H., et al. Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases. Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).
- Wyatt, A. P. The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder. J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).
- Mawe, G. M., Kennedy, A. L. Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig. Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).
- Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster. Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).
- Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum. Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. (62), e4042 (2012).
