Met behulp van een volledige immunohistochemische methode om de innervatie van de galwegen in te studeren<em> Suncus murinus</em
Summary
Een gehele-mount immunohistochemische aanpak, om de neurofilament eiwit expressie in het extrahepatische galweg in Suncus murinus te visualiseren. Wordt hier gepresenteerd. Dit protocol kan gebruikt worden om de innervering van alle viscerale organen in S. murinus of andere soorten te analyseren.
Abstract
Dit werk beschrijft de gehele berg immunohistochemie kleuring methode in detail, met behulp van neurofilament eiwit antilichaam voor het labelen van de innervatie van het galweg de Suncus murinus ( S. murinus ). Ten eerste werd het monster van S. murinus gescheiden en in 4% paraformaldehyde (PFA) gefixeerd. Ten tweede werd een enzymatische behandeling en potentiële endogene peroxidase-inactivering uitgevoerd. Het monster werd vervolgens blootgesteld aan het primaire antilichaam, anti-neurofilament eiwit antilichaam, gedurende 3-6 dagen. Het werd vervolgens geïncubeerd met het secundaire antilichaam dat is geconjugeerd met mierikswortelperoxidase. De kleurreactie werd geopenbaard door het monster te laten reageren met een 3,3'-diaminobenzidine (DAB) substraat. Deze methode kan worden toegepast om de innervering van alle viscerale organen te analyseren. Bovendien kan dit protocol ook worden aangepast om andere neuronale antilichamen te testen, maar optimalisatie van de antibodiesHet moet eerst gedaan worden. Deze methode werd oorspronkelijk geïntroduceerd door Kuratani en Tanaka 1 , 2 , 3 .
Introduction
De huismussklok , Suncus murinus , behoort tot de orde Insectivora en de familie Soricidae. Dit kleine zoogdier is verspreid over heel Zuidoost-Azië en woont in huizen en grasgebieden die zich bevinden in de buurt van menselijke woningen of veestokken 4 . Deze soort vertoont algemene morfologische kenmerken die vergelijkbaar zijn met mensen dan andere laboratoriumdieren, zoals de muis, de rat en het konijn 5 . Vroeger werd immunostaining met een perifere neuronmarkering voor S. murinus neurofilament eiwit (NFP) gebruikt om perifere zenuwen in de alvleesklier 6 , hoofdduodenale papilla 7 , pylorus 8 , galblaas 5 en extrahepatische galwegen 9 te markeren.
NFP is een macromoleculaire complex die deel uitmaakt van het volwassen neuronale cytoskelet. Neurofilament-gerelateerd eiwitS bemiddelen interacties tussen NFP en de zygosoom. Zowel de enzymfunctie als de structuur van linkerproteïnen worden gereguleerd door NFP 10 . Het NFP-complex is gemaakt van drie polypeptiden: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) en NF-H (200 kDa). NFP kan worden gevonden in neuronale axonen in zowel het centrale als perifere zenuwstelsel. Anti-menselijk NFP antilichaam is aangetoond om axonen van het centrale en perifere zenuwstelsel te vermelden. Anatomische en elektrofysiologische onderzoeken hebben aangetoond dat de sfincter, galblaas en proximale maagdarmkanaal 11 , 12 , 13 , 14 verbonden zijn. Echter, de morfologische kenmerken van hun neuronale verbindingen zijn nog niet gedefinieerd.
Dit werk demonstreert het gebruik van een volledig-mount immunohistochemische kleuring methode om de innervation van de S. murinus bilIary kanaal met een NFP antilichaam.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit werk beschrijft de experimentele procedure voor het visualiseren van de innervatie van het extrahepatische galwegstelsel met behulp van een antilichaam tegen neurofilament eiwit. Dit protocol werd aangepast uit het protocol beschreven door Kuratani en Tanaka 1 , 2 , 3 .
Bepaal voor dit experiment de tijdlijn voor elk van de experimenten, aangezien de full-mount staining-aanpak 2-3 weken blijft. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs hebben geen erkenningen.
Materials
| orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
| papain | Wako | 164-00172 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Wako | 010-15131 | |
| sodium azide | Nacalai Tesque | 312-33 | |
| neurofilament protein (NFP) antibody | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
| peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Wako | 349-00903 | |
| imidazole | Sigma | I-0125 |
References
- Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method. Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung. Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of avian trigeminal nerves. Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).
- Yi, S. Q., et al. House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model. Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy. World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).
- Yi, S. Q., et al. Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures. Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy. World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).
- Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study. Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).
- Wang, H., et al. Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases. Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).
- Wyatt, A. P. The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder. J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).
- Mawe, G. M., Kennedy, A. L. Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig. Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).
- Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster. Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).
- Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum. Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. (62), e4042 (2012).
