Användning av en helmonterad immunhistokemisk metod för att studera gallringens innervation i<em> Suncus murinus</em
Summary
En helmonterad immunohistokemisk metod för att visualisera neurofilamentproteinuttryck i det extrahepatiska gallvägen i Suncus murinus. Presenteras här. Detta protokoll kan användas för att analysera innervärdet av alla viscerala organ i S. murinus eller andra arter.
Abstract
Detta arbete beskriver den fullständiga monteringen av immunhistokemiska färgmetoder i detalj, med användning av neurofilamentproteinantikroppar för att märka innervation av gallvägarna i Suncus murinus ( S. murinus ). Först dissekerades provet från S. murinus och fixerades i 4% paraformaldehyd (PFA). För det andra utfördes en enzymatisk behandling och potentiell endogen peroxidasinaktivering. Provet exponerades sedan för den primära antikroppen, anti-neurofilamentproteinantikroppen, i 3-6 dagar. Den inkuberades sedan med den sekundära antikroppen konjugerad med pepparrotsperoxidas. Färgreaktionen avslöts genom att reagera provet med ett 3,3'-diaminobensidin (DAB) substrat. Denna metod kan tillämpas för att analysera innerveringen av alla viskosorgan. Vidare kan detta protokoll också anpassas för att testa andra neuronala antikroppar, men optimering av antibodiesEs bör göras först. Denna metod introducerades ursprungligen av Kuratani och Tanaka 1 , 2 , 3 .
Introduction
Husets muskeshuggare , Suncus murinus , tillhör ordningen Insectivora och familjen Soricidae. Detta lilla däggdjur distribueras i hela Sydostasien och bevarar hus och gräsbevuxna områden som ligger nära mänskliga livsmiljöer eller nötkreaturpennor 4 . Denna art uppvisar allmänna morfologiska egenskaper som liknar människor än andra laboratoriedjur, såsom mus, råtta och kanin 5 . Tidigare användes helmonterad immunförstärkning med en perifer neuronmarkör för S. murinus neurofilamentprotein (NFP) för att märka perifera nerver i bukspottkörteln 6 , huvudduodenal papillan 7 , pylorus 8 , gallblåsan 5 och extrahepatisk gallvägar 9 .
NFP är ett makromolekylärt komplex som ingår i den mogna neuronala cytoskeletten. Neurofilamentrelaterat proteinS mediera interaktioner mellan NFP och zygosomen. Både enzymfunktionen och strukturen hos linkerproteiner regleras av NFP 10 . NFP-komplexet är tillverkat av tre polypeptider: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) och NF-H (200 kDa). NFP kan hittas i neuronal axon i både det centrala och perifera nervsystemet. Anti-human NFP-antikropp har visat sig markera axoner i det centrala och perifera nervsystemet. Anatomiska och elektrofysiologiska undersökningar har visat att sfinkteren, gallblåsan och proximal mag-tarmkanalen är anslutna 11 , 12 , 13 , 14 . De morfologiska egenskaperna hos deras neuronala förbindelser har emellertid ännu inte definierats.
Detta arbete demonstrerar användningen av en helmonterad immunohistokemisk färgmetod för att märka innervationen av S. murinus bilIarykan med en NFP-antikropp.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta arbete beskriver det experimentella förfarandet för visualisering av det extrahepatiska gallvägarnas innervation genom att använda en antikropp mot neurofilamentprotein. Detta protokoll anpassades från protokollet som beskrivs av Kuratani och Tanaka 1 , 2 , 3 .
För detta experiment, planera tidslinjen för vart och ett av experimenten, eftersom hela monteringsfärgningen fortsätter i 2-…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna har inga bekräftelser.
Materials
| orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
| papain | Wako | 164-00172 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Wako | 010-15131 | |
| sodium azide | Nacalai Tesque | 312-33 | |
| neurofilament protein (NFP) antibody | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
| peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Wako | 349-00903 | |
| imidazole | Sigma | I-0125 |
References
- Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method. Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung. Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of avian trigeminal nerves. Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).
- Yi, S. Q., et al. House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model. Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy. World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).
- Yi, S. Q., et al. Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures. Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy. World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).
- Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study. Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).
- Wang, H., et al. Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases. Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).
- Wyatt, A. P. The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder. J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).
- Mawe, G. M., Kennedy, A. L. Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig. Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).
- Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster. Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).
- Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum. Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. (62), e4042 (2012).
