酵素的に活性G4 Resolvase1の精製のためのG-四重鎖DNA親和性のアプローチ
Summary
G4 Resolvase1はG4結合タンパク質のための最も厳しい報告親和性でG-四重鎖（G4）の構造に結合し、HeLa細胞におけるG4-DNA巻き戻し活性の大部分を表しています。我々は、具体的には、触媒活性組換えG4R1を精製するための親和性およびG4-Resolvase1のATP依存性巻き戻し活性を活かした新たなプロトコルを記述します。
Abstract
高次核酸構造は、両方のDNAおよびRNAのグアニンリッチ領域に形成することができ、G四重鎖（G4において、G4構造）と呼ばれ、非常に熱的に安定です。そこヒトゲノム中に375,000の推定上のG4形成配列が>であり、それらは、プロモーター領域、非翻訳領域（UTR）、およびテロメア反復内で濃縮されています。このような複製および転写などの細胞プロセスに影響を与えるために、これらの構造のための潜在的に、細胞は、それらを管理するために酵素を進化してきました。 1つのこのような酵素は生化学的に我々の研究室と長嶺らが共同で特徴付けられたG4リゾルバーゼ1（G4R1）、です。そして、G4-DNAとG4-RNA（低pMの範囲内の K d）の両方に非常に強固に結合することが判明。 G4R1は、HeLa細胞溶解物中のG4分解活性の大部分の原因であるとからテロメア代謝、リンパ開発、遺伝子転写、造血および免疫監視において役割を果たすことが示唆されています。 EFする能力ficiently表現し、触媒活性G4R1がG4構造とG4分解酵素の動力学的相互作用にさらなる洞察を得ることに興味を持って研究室のために重要である浄化。ここでは、組換えG4R1（rG4R1）の精製のための詳細な方法について説明します。説明する手順は、C末端ヒスチジンタグ付き酵素の伝統的な親和性に基づく精製は、ATPで活性の高い酵素を精製するために、G4-DNAに結合し、くつろぐのにrG4R1の能力の活用でヒト・コドン最適化された細菌において発現組み込ん依存溶出工程。プロトコルはまたrG4R1の酵素活性は、G4-DNAをほどくする精製酵素の能力を調べることによって測定される品質管理ステップを含みます。この方法はまた、精製rG4R1の定量化を可能にすることが記載されています。このプロトコルの代替適応が議論されています。
Introduction
G4構造は、DNAやRNAのグアニンリッチ領域内に形成安定性の高い核酸の二次構造です。 G4構造は、フーグスティーン結合相互作用を介して安定化され、大幅G4構造1、2の顕著な熱安定性に貢献する一価の陽イオン（ すなわち 、K +およびNa +）と中央の空洞内に配位結合しています。初期のバイオインフォマティクス研究は、ヒトゲノムは> 375,000 "潜在的なG4形成モチーフ「3、4含まれていることを示唆しました。さらに最近の研究で推定値は、別の研究は、ヒトゲノム6の716310の異なる潜在的なG4形成配列を予測しながら、G4モチーフの数は、2-5 5倍高いことを示唆しています。 G4形成配列は、進化的に保存し、ランダムに分散されていませんゲノム。 G4のモチーフは、遺伝子コード領域に濃縮され、そしてすべての遺伝子プロモーターの40％の上方には、G4モチーフ7を含んでいます 。興味深いことに、遺伝子G4モチーフの富化の程度は、遺伝子の機能を示唆することが実証されています。例えば、開発に関与するプロトオンコジーンおよび遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子8,9よりG4構造の有意に高い濃縮度を有しています。
高い熱安定性により、ゲノム全体でほぼユビキタスプレゼンス、および大幅に主要な細胞プロセスに影響を与える可能性、細胞がこれらの構造を管理するために酵素を進化させたことを見つけるために驚くべきことではありません。 、我々はヒト（HeLa細胞）細胞10内tetramolecular G4-DNA解消活性の大部分のソースとして特徴づけ; 1つのこのような酵素はG4 Resolvase1（また、ラウとDHX36呼ばG4R1）です。それ以来、それが示されているTHAトンG4R1はしっかりと結合し、触媒G4結合タンパク質11、12、13のための最も厳しい報告KDSとtetramolecularと単分子G4-DNAとG4-RNAを巻き戻します。さらに、G4R1のG4分解活性は、テロメア/テロメラーゼ生物学11、14、15、16、転写及びスプライシング17、18、19、20、現像21、造血を含む生化学的および細胞プロセスの広い範囲に関与しています21、及び免疫調節22、23。 G4シーケンスが優勢と特異的にゲノムと多様な細胞のp全域にG4R1は最近表現し、効率的に高活性rG4R1を精製する能力は、このタンパク質の生化学的メカニズムや行動を解明するために最も重要なのだろう、と関与することが示唆されていることをrocesses。
ここでは、効率的に活性酵素を単離するためにrG4R1のATP依存性、G4分解活性を利用して新規発現および精製スキーム（ 図1）を示しています。このスキームは、酵素反応の生成物は、もはやG4R1の場合のように、結合のための基質であるため、他のATP依存性核酸酵素を精製するために適合させることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、DHX36遺伝子産物、G4-Resolvase1（またラウとDHX36呼ばG4R1）（ 図1）を単離するための非常に効率的な発現、精製、および定量化スキームを表します。 G4-DNA複合化ビーズ上のHisタグの親和性コバルト親和性ビーズ上での精製と酵素精製：このプロトコルは、2つの精製工程を利用しています。後者のステップは、それがrG4R1はG4構造に持っているタイトな親和性、高特…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は（PJS）は寛大（JPVに）陶器財団からの贈り物、（PJSへ）HealthGrant T32-CA079448の国立研究所、およびボール州立大学のスタートアップ資金を含め、当社の資金源に感謝したいと思います。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備で何の役割を持っていません。
Materials
| TriEx4-DHX36 plasmid | Addgene | 68368 | |
| Rosetta2(DE3)plysS competent cells | Novagen | 71403-4 | |
| S.O.C medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Difco Terrific Broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | 35 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Carbenicillin (plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C3416 | 50 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Lysozyme (from chicken egg white) | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 1 M Tris-HCl pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 1963-B | or From standard source |
| 1 M Tris-HCl pH=7 | Universal Scientific Supply Co. | 1966 | or From standard source |
| 1.5 M Tris-HCl, pH=8.8 | For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-HCl, pH=6.8 | For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-Acetate, pH=7.8 | Universal Scientific Supply Co. | 1981 | or From standard source |
| 70% Ethanol | From standard source | ||
| Magnesium chloride (1 M solution) | Life Technologies | AM9530G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | |
| 20x SSC | Universal Scientific Supply Co. | 1665 | or From standard source |
| β-mercaptoethanol (2-BME) | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Streptavidin paramagnetic beads | Promega | Z5482 | |
| 0.5 M EDTA, pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 0718 | or From standard source |
| 0.2 M EDTA, pH=6 | Universal Scientific Supply Co. | From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl. | |
| A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) | Sigma-Aldrich | L5385 | |
| Cobalt metal affinity beads | Clonetech | 635502 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) | Sigma | A7699 | |
| 40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) | Biorad | 161-0148 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS) |
| 10 % Sodium dodecyl sulfate | Universal Scientific Supply Co. | 1667 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source |
| 10x TBE | Sigma-Aldrich | 11666703001 | or From standard source |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source |
| TEMED | Sigma-Aldrich | 411019 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Broad Range Protein MW markers | Promega | V8491 | |
| Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") | Oligos Etc | 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’ | |
| TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") | Oligos Etc | 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’ | |
| Fluor-coated TLC plate | Life Technologies | AM10110 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | 30% in H2O |
| Coomassie R-250 | Sigma-Aldrich | 27816 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Multiband UV lamp | Capable of emitting UV light at 365 nm | ||
| Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Microcentrifuge | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Digital Sonfier | Branson | Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF) | |
| 50 °C water bath | For formation of Z33 into quadruplex | ||
| 37 °C incubator for bacteria | For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| 37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria | For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| Spectrophotometer | capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000) | ||
| Thermometer | From standard source | ||
| PCR strip tubes | From standard source | ||
| 15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene) | From standard source | ||
| Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | From standard source | ||
| 500 ml centrifuge bottles (polypropylene) | Thermo Scientific | 3141-0500 | |
| Standard array of pipet tips and serological pipettes | From standard source | ||
| Gel-loading tips | From standard source | ||
| Automatic repeating pipette | For quick aliquoting of rG4R1; From standard source | ||
| Thermal cycler | From standard source | ||
| Liquid Nitrogen | From standard source | ||
| Dry ice | From standard source | ||
| Laemlli sample buffer | Biorad | 161-0737 | |
| Apparatus for running large slab gels | Biorad | We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad | |
| Magnet | Life Technologies | 12301D | We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement |
| Razor blades | From standard source | ||
| Filter paper and funnel | From standard source | ||
| Glass casserole dish | From standard source | ||
| Orbital shaker | From standard source | ||
| Kimwipes | From standard source | ||
| Clear sheet protectors | From standard source | ||
| Scanner and associated TWAIN software | From standard source | ||
| Image analysis software | Such as Fuji Multiguage, or equivalent | ||
| Microsoft Excel | Or equivalent |
References
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