JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Neurosciences

Whole-cell Patch-clamp optagelser til elektrofysiologisk bestemmelse af ion selektivitet i Channelrhodopsins

Published: May 22, 2017
doi:
10.3791/55497
, , ,
1Experimental Biophysics, Institute of Biology,Humboldt-Universität zu Berlin

Summary

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Abstract

I løbet af det sidste årti blev kanalrhodopsiner blevet uundværlige i neurovidenskabelig forskning, hvor de bruges som redskaber til ikke-invasiv manipulation af elektriske processer i målceller. I denne sammenhæng er ion selektivitet af en kanalrhodopsin af særlig betydning. Denne artikel beskriver undersøgelsen af ​​klorid-selektivitet for et nyligt identificeret anionledende channelrhodopsin af Proteomonas sulcata via elektrofysiologiske patch-clamp-optagelser på HEK293-celler. Den eksperimentelle procedure til måling af lysgitterede fotokræfter kræver en hurtig omskiftelig – ideelt monokromatisk – lyskilde koblet i mikroskopet af en ellers konventionel patch-clamp opsætning. Præparative procedurer forud for eksperimentet er skitseret med fremstilling af pufrede opløsninger, overvejelser om væskeforbindelsespotentialer, podning og transfektion af celler og udtrækning af patchpipetter. Den aktuelle optagelse af strømspændingsforholdS for at bestemme reverseringspotentialerne for forskellige kloridkoncentrationer finder sted 24 timer til 48 timer efter transfektion. Endelig analyseres elektrofysiologiske data med hensyn til teoretiske overvejelser af chloridledning.

Introduction

Channelrhodopsiner (ChR) er lysdæmpede ionkanaler, der forekommer i øjnene på motile grønne alger, og tjener som primære fotosensorer til fototakse og fobiske reaktioner 1 . Siden deres første beskrivelse i 2002 2 har ChR'er banet vejen for det fremvoksende område af optogenetik og kan anvendes i en række forskellige excitente celler, f.eks. Inden for skelets muskler, hjertet eller hjernen 3 , 4 , 5 . Ekspression af ChR'er i målceller resulterer i lysstyrbar ionpermeabilitet af den respektive celle. I en neuronal sammenhæng tillader dette aktivering 6 , 7 , 8 eller inhibering 9 , 10 af actionpotentiale (AP) -affyring – afhængigt af den udførte ion – med det rumlige og tidsmæssigeLysets præcision understreger, hvordan ion-selektiviteten af ​​en ChR-variant bestemmer dens optogenetiske anvendelse.

De første opdagede ChRs fra Chlamydomonas reinhardtii og Volvox carteri er permeable til protoner, men også til monovalente kationer som natrium, kalium og i mindre grad til divalente kationer, såsom calcium og magnesium 11 , 12 , 13 . I dag har mere end 70 naturlige kation-ledende channelrhodopsiner (CCR'er) 14 , 15 , 16 , 17 og flere konstruerede varianter 18 , 19 , 20 med forskellige egenskaber som f.eks. Fotokurrensstørrelse, spektralfølsomhed, kinetik og kation selektivitet er tilgængelige. I neurovidenskab er CCR aRe bruges til at aktivere celler og udløse AP'er, var lysdrevne mikrobielle pumper de eneste tilgængelige antagonister til at silere neuroner i årevis. I 2014 viste to grupper samtidigt, at CCR'er kan omdannes til anionledende channelrhodopsiner (ACR'er) ved ændring af polariteten langs den formodede ionledende pore via molekylærteknik 9 , 21 . Derefter blev naturlige ACR'er identificeret i flere kryptofytealger 22 , 23 , 24 . Vigtigst er det, at lysaktivering af ACR'er medierer kloridstrømme i voksne neuroner, der tillader hæmning af neuronaktivitet ved meget lavere lysintensiteter end mikrobielle pumper, der kun transporterer enkeltladninger pr. Absorberet foton.

ChR-aktivitet kan adresseres direkte ved elektrofysiologiske patch-clamp-optagelser af lysinducerede strømme i HEK293-celler. KlipklemmenTeknik blev oprindeligt udviklet i slutningen af ​​1970'erne 25 og yderligere forbedret af Hamill et al. , Hvilket tillader registrering af enheden af ​​strømme fra en lille celle (helcelle-mode) med høj strømopløsning og direkte styring af membranspændingen 26 . Anvendt i cellekultur giver denne teknik nøjagtig kontrol af de ioniske såvel som elektriske registreringsbetingelser og muliggør undersøgelse af ionselektivitet sammen med det relative bidrag fra ionerne til den samlede strøm. Her eksemplificerer vi undersøgelsen af ​​ionelektivitet for den anionledende channelrhodopsin af Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 via optagelse af strømspændingsrelationer under forskellige ekstracellulære chloridkoncentrationer for at bevise højchloridkonduktans.

Protocol

Figur 1: Opsætning af patch-clamp. (1) lyskilde, (2) optisk fiber, (3) programmerbar lukker, (4) digitizer, (5) lukkerdriver, (6) forstærker, (7) perfusionssystem, (8) personlig computer, (10) faraday bur, (11) mikroskop stadium, (12) perfusion indløb, (13) perfusion udløb, (14) optagekammer, (15) væskeniveau sensor, (16) badelektrode med agar bro, Pipetteholder, (18) headstage, (19) micromanipul…

Representative Results

Figur 2 viser repræsentative resultater opnået ved målinger efter den beskrevne protokol. Under lyset med grønt lys har Ps ACR1 en hurtig forbigående strøm, der hurtigt falder til et stationært strømniveau. Når lyset er slukket, falder fotokoblerne til nul inden for millisekunder ( figur 2A ). Udveksling af den ekstracellulære chloridkoncentration forårsager et skift af reverseringspotentialet, der kan ses direkte i de overført…

Discussion

Bestemmelse af reverseringspotentialer ved definerede ioniske og elektriske betingelser tilvejebringer information om ionarten transporteret efter lysaktivering af ChRs. Hvis udelukkende en ionart varieres i et komplekst fysiologisk medium, og de opnåede reverseringspotentialeskift i henhold til det teoretiske Nernst-potentiale, er denne ionart den eneste transporterede.

For ChRs er reverseringspotentialeforskydninger sædvanligvis mindre udtalte end forventet fra Nernst-ligningen på grund…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Maila Reh, Tharsana Tharmalingam og især Altina Klein for fremragende teknisk assistance. Dette arbejde blev støttet af det tyske forskningsstiftelse (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 til PH) og Cluster of Excellence Unifying Concepts i Catalysis, UniCat, BIG-NSE (JV) og E4 (PH).

Materials

HEK293 cells Sigma Aldrich 85120602 Human embryonic kidney cells
Retinal Sigma Aldrich R2500 all-trans retinal
FuGENE HD Promega E2312 Transfection reagent
DMEM Biochrome FG 0445 Dulbecco's Modified Eagle Medium
Agarose Roth 3810 Agar bridges
CaCl2 Roth 5239 CaCl2 2H2O
CsCl Biomol 2452
EGTA Roth 3054
FBS Biochrome S0615 Cell culture
Glucose Roth HN06 D(+)-Glucose
KCl Roth 6781
MgCl2 Roth 2189 MgCl2 6H2O
NaCl Roth 3957
NMG Sigma Aldrich M2004 N-Methyl-D-glucamine
Na-Aspartate Sigma Aldrich A6683 L-Aspartic acid sodium salt monohydrate
Citric acid Roth 6490
AgeI ThermoFischerScientific ER1462 Restriction enzyme
XhoI ThermoFischerScientific ER0695 Restriction enzyme
NheI ThermoFischerScientific ER0975 Restriction enzyme
XL1Blue E.coli/ Agilent Technologies 200249 Chemocompetent E.coli
Kanamycin Roth T832
Lysogeny broth medium Roth X964
Agar-Agar Roth 6494 Agar plates
Plasmid purification kit Marchery-Nagel 740727.25
Penicilin/Streptomycin Biochrome A 2213 Cell culture
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma Aldrich P6407-5MG Cover slip coating
Microforge Custom made Fire polishing
Serological pipettes TPP Different sizes
Clean bench Kojair Biowizard SL130
Stirrer IKA RCT classic
Silver wire Science Products AG-T25; AG-T10 Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode)
pH-meter Knick 765 Calimetric
Osmometer Vogel OM 815
Microscope Carl Zeiss ID03 Fire polishing
CO2 incubator Binder CB150
Cell culture dishes TPP 93040 34 mm internal diameter
Cover slips Roth P232 15 mm diameter
Thermometer Rössel Messtechnik MTM12
Beamsplitter Chroma 21011 90/10 transmission
Pipette holder ALA Scientific Instruments PPH-1P-AXU-0-1.5
Headstage Molecular Devices CV203BU
Amplifier Molecular Devices AxoPatch200B
Digitizer Molecular Devices DigiData1400 Digital analog converter
Lightsource TILL Photonics Polychrome V Set to 540 nm full intensity
Microscope Carl Zeiss Axiovert 100
Shutter Vincent Associates VS25
Shutter driver Vincent Associates VCM-D1
Glass capilarries Warner Instruments G150F-3 Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID  0.86 mm
Micropipette puller Sutter Instruments P1000
Bath handler Lorenz Messgerätebau MPCU
Tripleband filterset Chroma 69008 Fluorescence filter  ECFP/EYFP/mCherry 
CCD camera Watec Wat-221SCCD
Optometer Gigahertz Optik P9710 Measure light intensities
Objective Carl Zeiss 421462-9900-000 W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
Micromanipulator Scientifica PatchStar
Recording chamber Custom made
Power supply Manson HCS-3202 Avoids electrical noise from microscope built-in power supply
Vibration isolated table Newport M-VW-3636-OPT-01
Faraday cage Custom made or any commercial matching table
Hoses Any comercial; e.g. Roth Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges
Linear shaker Sunlab Instruments SU 1000
Liquid junction potential calculator Molecular Devices or directly from Peter H. Barry Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from  p.barry@unsw.edu.au
Data acquisition software Molecular Devices Clampex 10.X
Data evaluation software Molecular Devices Clampfit 10.X
PsACR1 GenBank or Addgene KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 Gene encoding for PsACR1
Amplifier guide Molecular Devices The Axon Guide
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
  2. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
  3. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle. Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).
  4. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
  5. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
  6. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  7. Li, X., et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).
  8. Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).
  9. Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), 409-412 (2014).
  10. Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).
  11. Tsunoda, S. P., Hegemann, P. Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation. Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).
  12. Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. Ion selectivity and competition in channelrhodopsins. Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).
  13. Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride. MBio. 2 (3), 1-9 (2011).
  14. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis. J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).
  15. Hou, S. -. Y., et al. Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins. Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).
  16. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  17. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
  18. Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).
  19. Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a., Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).
  20. Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel. Science. 344 (6182), 420-424 (2014).
  21. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin. Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).
  22. Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata. J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).
  23. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
  24. Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).
  25. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).
  26. Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
  27. Amtmann, A., Sanders, D. A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes. J. Exp. Bot. 48, 361-364 (1997).
  28. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  29. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).
  30. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  31. Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. Using microelectrodes. Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).
  32. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).
  33. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  34. Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).
  35. Prigge, M., et al. Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics. J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).
  36. Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. Rectification of the channelrhodopsin early conductance. Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).
  37. Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
  38. Wietek, J., Prigge, M. Enhancing Channelrhodopsins: An Overview. Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).
  39. Ferenczi, E. A., et al. Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability. Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).
  40. Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).
  41. Sugiyama, Y., et al. Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2. Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).
  42. Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).
  43. Wang, H., et al. Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas. J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).
  44. Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).
  45. Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).

Tags

Keywords: Whole-cell Patch-clampElectrophysiologyIon SelectivityChannelrhodopsinsHEK CellsTransfectionPhotocurrentBiophysicsIntracellular BufferExtracellular BufferOsmolarityPatch PipetteFire PolishingRecording Chamber
check_url/fr/55497?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Grimm, C., Vierock, J., Hegemann, P., Wietek, J. Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins. J. Vis. Exp. (123), e55497, doi:10.3791/55497 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image