תא שלם תיקון מהדק הקלטות עבור קביעת electrophysiological של יון סלקטיביות ב Channelrhodopsins
Summary
This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.
Abstract
במהלך העשור האחרון, channelrhodopsins הפך חיוני במחקר neuroscientific שבו הם משמשים כלים לא פולשני לתפעל תהליכים חשמליים בתאי היעד. בהקשר זה, סלקטיביות יון של channelrhodopsin הוא בעל חשיבות מיוחדת. מאמר זה מתאר את החקירה של סלקטיביות כלוריד עבור לאחרונה זיהו anion-channelrhodopsin ניטור של Proteomonas sulcata באמצעות הקלטות קליפ תיקון אלקטרו על תאים HEK293. ההליך הניסויי למדידת צילומי האור הנשלטים על ידי האור דורש תמסורת מהירה – מונוכרומטית – מקור אור צמוד למיקרוסקופ של תצורת טלאי קונבנציונאלי. ההליכים ההכנה לפני הניסוי מתוארים הכנת פתרונות שנאגרו, שיקולים על פוטנציאל צומת נוזלים, זריעה transfection של תאים, ו משיכת טפיחות תיקון. ההקלטה בפועל של יחסי המתח הנוכחיS כדי לקבוע את הפוטנציאל היפוך עבור ריכוזי כלוריד שונים מתרחש 24 שעות עד 48 שעות לאחר transfection. לבסוף, נתונים אלקטרופיזיולוגיים מנותחים ביחס לשיקולים תיאורטיים של הולכה כלוריד.
Introduction
Channelrhodopsins (CHR) הם ערוצי יון אור מגודלים המתרחשים בנקודת העין של אצות ירוקות נעות, ומשמשים כמחזירים ראשוניים עבור פוטוטקסיס ותגובות פוביות 1 . מאז התיאור הראשון שלהם בשנת 2002, ChRs סללו את הדרך עבור השדה המתעוררים של optogenetics ויכול להיות מיושם במגוון של תאים נרגשים למשל בתוך שרירי השלד, הלב, או את המוח 3 , 4 , 5 . ביטוי של CHRs בתאי היעד גורם חדירות אור יון לשליטה של התא בהתאמה. בהקשר נוירוני, זה מאפשר הפעלה 6 , 7 , 8 או עיכוב 9 , 10 של פעולה פוטנציאליים (AP) ירי – בהתאם יון שנערך – עם הזמן המרחבידיוק של אור המדגיש כיצד סלקטיביות יון של גרסה ChR קובעת יישום optogenetic שלה.
גידולי CHR הראשונים שהתגלו מ – Chlamydomonas reinhardtii ו- Volvox carteri חדירים לפרוטונים, אך גם לקטיונים מונוולנטיים כמו נתרן, אשלגן, ובמידה פחותה גם לקטיונים דו-קלים כגון סידן ומגנזיום 11 , 12 , 13 . כיום, יותר מ -70 קטיונים טבעיים (cCR) 14 , 15 , 16 , 17 וריאנטים מהונדסים שונים 18 , 19 , 20 עם מאפיינים שונים כגון גודל פוטו, רגישות ספקטרלית, קינטיקה, סלקטיביות קטיון זמינים. בעוד בתחום מדעי המוח, CCRs אששימשו להפעלת תאים ומפעילי APPS, משאבות מונעות על ידי אור, היו היריבים הזמינים רק עבור נוירונים משתיקים במשך שנים. בשנת 2014, שתי קבוצות הראו בו זמנית כי CCRs ניתן להמיר anion-conductrhopsops ניצח אניון (ACRs) על ידי שינוי של הקוטביות לאורך יון putative ניצוח באמצעות הנדסה מולקולרית 9 , 21 . לאחר מכן, ACRs טבעיים זוהו בכמה קריפטופיטים 22 , 23 , 24 . והכי חשוב, הפעלה קלה של ACRs מתווכת זרמי כלוריד נוירונים מבוגרים המאפשר עיכוב של הפעילות העצבית בעוצמות האור הרבה יותר נמוך מאשר משאבות מיקרוביאליות כי רק הובלה יחיד חיובי לכל פוטון נספג.
פעילות ChR ניתן לטפל ישירות על ידי אלקטרו קליפ הקלטות אלקטרומגנטית של זרמים האור המושרה בתאים HEK293. מהדק התיקוןהטכניקה פותחה במקור בסוף שנות ה -70 25 ושיפר עוד יותר על ידי Hamill et al. , המאפשר הקלטה של ישות של זרמים מתא קטן (מצב תא שלם) עם רזולוציה גבוהה הנוכחי שליטה ישירה של מתח קרום 26 . יישומי בתרבית תאים, טכניקה זו מספקת שליטה מדויקת של תנאי ההקלטה יונית כמו גם חשמל, ומאפשר לימוד סלקטיביות יון יחד עם התרומה היחסית של יונים לסך הנוכחי. כאן אנו מדגימים את בדיקת סלקטיביות יון עבור anion מנצח transrhodopsin של Proteomonas sulcata (פס ACR1) 22 , 23 באמצעות הקלטה של יחסי מתח הנוכחי תחת ריכוזי כלוריד תאיים שונים כדי להוכיח מוליכות כלוריד גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
קביעת הפוטנציאלים היפוך בתנאים יוניים וחשמליים מוגדר מספק מידע על מינים יון מועבר לאחר הפעלה קלה של CHR. אם באופן בלעדי יון אחד הוא מגוון במדיום פיזיולוגי מורכב ואת השינויים הפוטנציאליים היפוך המתקבל על פי הפוטנציאל Nernst תיאורטית, זה מין יון הוא היחיד מועבר אחד.
<p class…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Maila Reh, Tharsana Tharmalingam ובמיוחד Altina Klein לעזרה טכנית מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 ל- PH) ואשכול המצוינות המאחד קונספטים בקטליזה, UniCat, BIG-NSE (JV) ו- E4 (PH).
Materials
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E.coli/ | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E.coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
References
- Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle. Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Li, X., et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).
- Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).
- Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), 409-412 (2014).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).
- Tsunoda, S. P., Hegemann, P. Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation. Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).
- Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. Ion selectivity and competition in channelrhodopsins. Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).
- Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride. MBio. 2 (3), 1-9 (2011).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis. J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).
- Hou, S. -. Y., et al. Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins. Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).
- Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a., Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).
- Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel. Science. 344 (6182), 420-424 (2014).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin. Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).
- Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata. J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
- Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).
- Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
- Amtmann, A., Sanders, D. A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes. J. Exp. Bot. 48, 361-364 (1997).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. Using microelectrodes. Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).
- Prigge, M., et al. Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics. J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).
- Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. Rectification of the channelrhodopsin early conductance. Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
- Wietek, J., Prigge, M. Enhancing Channelrhodopsins: An Overview. Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).
- Ferenczi, E. A., et al. Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability. Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).
- Sugiyama, Y., et al. Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2. Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).
- Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).
- Wang, H., et al. Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas. J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).
- Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).
- Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).
