Registrazioni patch-clamp intere cellule per la determinazione elettrofisiologica della selettività ionica in Channelrhodopsins
Summary
This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.
Abstract
Negli ultimi dieci anni, i channelrhodopsins sono diventati indispensabili nella ricerca neuroscientificale, dove vengono utilizzati come strumenti per manipolare in modo non invasivo i processi elettrici nelle cellule bersaglio. In questo contesto, la selettività ionica di un channelrhodopsin è di particolare importanza. In questo articolo si descrive l'analisi della selettività di cloruro per una scanografia di Proteomonas sulcata recentemente identificata da anion-conducting channel mediante protezioni elettrofisiologiche di patch-clamp sulle cellule HEK293. La procedura sperimentale per misurare le fotocorri luminose richiede una sorgente luminosa rapida – idealmente monocromatica – accoppiata nel microscopio di una configurazione di patch-clamps altrimenti convenzionale. Sono state descritte procedure preparative prima dell'esperimento che prevedono la preparazione di soluzioni tamponate, considerazioni sui potenziali di giunzione liquidi, la semina e la trasfezione delle cellule e la trazione delle pipette patch. La registrazione effettiva della relazione di tensione-correnteS per determinare le potenzialità di inversione per diverse concentrazioni di cloruro si svolge 24 h a 48 h dopo la trasfezione. Infine, i dati elettrofisiologici vengono analizzati rispetto alle considerazioni teoriche della conduzione di cloruro.
Introduction
Channelrhodopsins (ChR) sono canali ionici leggeri che si verificano nel punto di occhio delle alghe verdi motile e servono come fotosensori primari per fototassi e risposte fobiche 1 . Dalla loro prima descrizione nel 2002 2 , i ChRs hanno aperto la strada per il campo emergente dell'ottogenetica e possono essere applicati in una varietà di cellule eccitabili, ad es. Nei muscoli scheletrici, nel cuore o nel cervello 3 , 4 , 5 . L'espressione di ChRs nelle cellule bersaglio produce una permeabilità ionica controllabile dalla luce della rispettiva cellula. In un contesto neuronale, questo consente l'attivazione 6 , 7 , 8 o inibizione 9 , 10 di cottura del potenziale d'azione (AP) – a seconda dello ione condotto – con lo spazio e temporaliPrecisione della luce sottolineando come la selettività ionica di una variante ChR determina l'applicazione ottogenetica.
I primi ChRs scoperti da Chlamydomonas reinhardtii e Volvox carteri sono permeabili a protoni, ma anche a cationi monovalenti come il sodio, il potassio e, in misura minore, a cationi bivalenti come il calcio e il magnesio 11 , 12 , 13 . Oggi, più di 70 cantipolisini naturali (CCR) 14 , 15 , 16 , 17 e varie varianti progettate 18 , 19 , 20 con proprietà diverse come La dimensione fotocirrente, la sensibilità spettrale, la cinetica e la selettività del cation sono disponibili. Mentre nella neuroscienza, CCRs aUtilizzati per attivare le cellule e attivare AP, le pompe microbiche a luce guidata sono stati gli unici antagonisti disponibili per annientare i neuroni. Nel 2014, due gruppi hanno dimostrato simultaneamente che i CCRs possono essere convertiti in channelrhodopsins (ACR) di anion-conducting mediante alterazione della polarità lungo il poro conducente ionico attraverso l'engineering molecolare 9 , 21 . Successivamente, ACR naturali sono stati identificati in diverse alghe di crittophyte 22 , 23 , 24 . Più importante, l'attivazione leggera di ACR mediata dalle correnti di cloruro nei neuroni adulti permette di inibire l'attività neuronale a intensità luminosa molto minori rispetto alle pompe microbiche che trasportano solo singole cariche per fotone assorbito.
L'attività di ChR può essere direttamente affrontata mediante registrazioni elettrofisiologiche di patch-clamp di correnti indotte da luce nelle cellule HEK293. La pinzettaLa tecnica è stata originariamente sviluppata alla fine degli anni '70 25 e ulteriormente migliorata da Hamill et al. , Consentendo la registrazione dell'entità delle correnti da una piccola cella (modalità di intera cellula) con alta risoluzione di corrente e controllo diretto della tensione della membrana 26 . Applicata nella coltura cellulare, questa tecnica fornisce un preciso controllo delle condizioni di registrazione ioniche e elettriche e consente di studiare la selettività degli ioni insieme al relativo contributo degli ioni alla corrente totale. Qui esemplifica l'esame della selettività ionica per il channelrhodopsin di Anion -conducting di Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 attraverso la registrazione di relazioni di tensione-corrente in varie concentrazioni di cloruro extracellulare per dimostrare un'elevata conduttanza di cloruro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Determinazione dei potenziali di inversione a condizioni ioniche e elettriche definite fornisce informazioni sulle specie ioniche trasportate dopo l'attivazione luminosa dei ChRs. Se solo una specie di ioni varia in un complesso complesso fisiologico e il potenziale di inversione ottenuto si sposta in base al potenziale teorico di Nernst, questa specie ione è l'unico trasportato.
Tuttavia, per i ChRs, i cambi potenziali di inversione sono generalmente meno pronunciati di quelli prev…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Maila Reh, Tharsana Tharmalingam e specialmente Altina Klein per un'ottima assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione di Ricerca Tedesca (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 a PH) e il Cluster of Excellence Unifying Concepts in Catalysis, UniCat, BIG-NSE (JV) e E4 (PH).
Materials
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E.coli/ | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E.coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
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