This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.
Under det senaste decenniet blev kanalrhodopsiner oundgängliga i neurovetenskaplig forskning där de används som verktyg för att icke-invasivt manipulera elektriska processer i målceller. I detta sammanhang är jonselektivitet hos en kanalrhodopsin av särskild betydelse. Denna artikel beskriver undersökningen av kloridselektivitet för ett nyligen identifierat anjonledande kanalrhodopsin av Proteomonas sulcata via elektrofysiologiska patch-clamp-inspelningar på HEK293-celler. Det experimentella förfarandet för mätning av ljusgolvade fotokräm kräver en snabb omkopplingsbar – idealiskt monokromatisk – ljuskälla kopplad i mikroskopet av en annars konventionell patch-clamp setup. Preparativa förfaranden före experimentet beskrivs med beredning av buffrade lösningar, överväganden om vätskeförbindningspotentialer, sådd och transfektion av celler och dra av patchpipetter. Den faktiska inspelningen av strömspänningsrelationenS för att bestämma reverseringspotentialerna för olika kloridkoncentrationer sker 24 h till 48 h efter transfektion. Slutligen analyseras elektrofysiologiska data med avseende på teoretiska överväganden av kloridledning.
Channelrhodopsiner (ChR) är lätta gatedjonskanaler som förekommer i ögonplatsen av motila gröna alger och fungerar som primära fotosensorer för fototax och fobsvar 1 . Sedan den första beskrivningen 2002 har ChRs banat vägen för det framväxande området av optogenetik och kan appliceras i en mängd olika excitativa celler, t.ex. inom skelettmusklerna, hjärtat eller hjärnan 3 , 4 , 5 . Uttryck av ChRs i målceller resulterar i ljusstyrbar jonpermeabilitet hos respektive cell. I ett neuronalt sammanhang möjliggör detta aktivering 6 , 7 , 8 eller inhibering 9 , 10 av actionpotential (AP) avfyring – beroende på den genomförda jonen – med rumsliga och tidsmässigaPrecision av ljus som betonar hur jonselektiviteten hos en ChR-variant bestämmer dess optogenetiska tillämpning.
De första upptäckta ChRs från Chlamydomonas reinhardtii och Volvox carteri är permeabla mot protoner, men också till monovalenta katjoner som natrium, kalium och i mindre utsträckning divalenta katjoner såsom kalcium och magnesium 11 , 12 , 13 . Idag har mer än 70 naturliga katjonledande kanalrhodopsiner (CCR) 14 , 15 , 16 , 17 och flera manipulerade varianter 18 , 19 , 20 med olika egenskaper såsom Fotokurrensstorlek, spektral känslighet, kinetik och katjon selektivitet är tillgängliga. I neurovetenskap, CCR aRe används för att aktivera celler och utlösande AP, lättade mikrobiella pumpar var de enda tillgängliga antagonisterna för att tysta neuroner i åratal. Under 2014 visade två grupper samtidigt att CCR kan omvandlas till anjonledande kanalrhodopsiner (ACR) genom förändring av polariteten längs den förmodade jonledande poren via molekylär teknik 9 , 21 . Därefter identifierades naturliga ACR i flera kryptofytealger 22 , 23 , 24 . Viktigast är att ljusaktivering av ACR medierar kloridströmmar i vuxna neuroner som tillåter hämning av neuronaktivitet vid mycket lägre ljusintensiteter än mikrobiella pumpar som endast transporterar enstaka laddningar per absorberad foton.
ChR-aktivitet kan adresseras direkt genom elektrofysiologiska patch-clamp-inspelningar av ljusinducerade strömmar i HEK293-celler. PlåstretTeknik utvecklades ursprungligen i slutet av 1970-talet 25 och ytterligare förbättrats av Hamill et al. , Vilket möjliggör registrering av enheten av strömmar från en liten cell (helcellsmodus) med hög strömupplösning och direkt styrning av membranspänningen 26 . Applicerad i cellodling ger denna teknik noggrann kontroll över de joniska och elektriska inspelningsförhållandena och möjliggör studier av jonselektivitet tillsammans med jonernas relativa bidrag till den totala strömmen. Här exemplifieras undersökningen av jonselektivitet för det anjonledande kanalhormoninet av Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 via inspelning av strömspänningsrelationer under olika extracellulära kloridkoncentrationer för att bevisa högkloridkonduktans.
Bestämning av reverseringspotentialer vid definierade joniska och elektriska betingelser ger information om jonarten transporterad efter ljusaktivering av ChRs. Om exklusivt en jonart varieras i ett komplext fysiologiskt medium och de erhållna reverseringspotentialskiften enligt den teoretiska Nernst-potentialen är denna jonart den enda transporterade.
För ChRs är reverseringspotentialskiftet vanligen mindre uttalade än förväntat från Nernst-ekvationen på grund av permeabilitet fö…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Maila Reh, Tharsana Tharmalingam och särskilt Altina Klein för utmärkt tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av den tyska forskningsstiftelsen (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 till PH) och Cluster of Excellence Unifying Concepts i Catalysis, UniCat, BIG-NSE (JV) och E4 (PH).
HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
CsCl | Biomol | 2452 | |
EGTA | Roth | 3054 | |
FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
KCl | Roth | 6781 | |
MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
NaCl | Roth | 3957 | |
NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
Citric acid | Roth | 6490 | |
AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
XL1Blue E.coli/ | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E.coli |
Kanamycin | Roth | T832 | |
Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
Microforge | Custom made | Fire polishing | |
Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
Stirrer | IKA | RCT classic | |
Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
Osmometer | Vogel | OM 815 | |
Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
CO2 incubator | Binder | CB150 | |
Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
Recording chamber | Custom made | ||
Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |