Channelrhodopsins'teki İyon Seçiciliğinin Elektrofizyolojik Olarak Belirlenmesi için Tam Hücreli Yama Kelepçesi Kayıtları
Summary
This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.
Abstract
Geçtiğimiz on yıl boyunca, kanalhodopsinler nörobilimsel araştırmalarda vazgeçilmez bir unsur haline geldi ve hedef hücrelerdeki elektrik süreçlerini invaziv olmayan bir şekilde manipüle etmek için kullanılan araçlar haline geldi. Bu bağlamda, bir kanalhodopsinin iyon seçiciliği özellikle önem taşımaktadır. Bu makale, HEK293 hücrelerindeki elektrofizyolojik yama-klemp kayıtları yoluyla Proteomonas sulcata'nın yakın zamanda tanımlanmış bir anyon iletici kanallıdopsininin klorür seçiciliğinin araştırmasını açıklamaktadır. Işık geçitli fotokroallerinin ölçülmesine yönelik deneysel prosedür, hızlı bir şekilde değiştirilebilir – ideal olarak monokromatik bir ışık kaynağı gerektirir, aksi halde geleneksel bir patch-clamp tertibatının mikroskopta birleştirilir. Deneyden önce preparatif prosedürler, tamponlanmış solüsyonların hazırlanması, sıvı bağlantı potansiyelleri üzerine düşünceler, hücrelerin tohumlanması ve transfeksiyonu ve yama pipetlerinin çekilmesi ile ilgili olarak özetlenmektedir. Akım-gerilim ilişkisinin gerçek kaydıS farklı klorür konsantrasyonları için reversal potansiyelleri belirlemek için transfeksiyondan 24 saat sonra 48 saat gerçekleşir. Son olarak, elektrofizyolojik veriler, klorür iletiminin teorik düşüncelerine göre analiz edilir.
Introduction
Channelrhodopsins (ChR), hareketli yeşil alglerin göz noktasında bulunan ve fototaksis ve fobik reaksiyonlar için birincil fotosensör olarak işlev gören ışık geçmeli iyon kanallarıdır. 2002'deki ilk tanımından bu yana, ChRs ortaya çıkan optogenetik alanın yolunu açtı ve iskelet kasları, kalp veya beyin 3 , 4 , 5 gibi çeşitli uyarılabilir hücrelerde uygulanabilir. ChR'lerin hedef hücrelerde ekspresyonu ilgili hücrenin ışık kontrollü iyon geçirgenliğine neden olur. Nöronal bağlamda, bu, aktarılan iyona bağlı olarak, hareket potansiyeli (AP) tetiklemenin 6 , 7 , 8 veya inhibisyon 9 , 10'un mekansal ve zamansalIşık hassasiyeti, bir ChR varyantının iyon seçiciliğinin optogenetik uygulamasını nasıl belirlediğini vurgular.
Chlamydomonas reinhardtii ve Volvox carteri'den keşfedilen ilk ChRs, protonlara , ayrıca sodyum, potasyum gibi monovalent katyonlara ve daha az oranda kalsiyum ve magnezyum gibi iki değerlikli katyonlara karşı geçirgendir11,12,13. Bugün, 70'den fazla doğal katyon ileten kanalrodopsin (CCR) 14 , 15 , 16 , 17 ve değişik özelliklere sahip 18 , 19 , 20 değişik mühendislik varyasyonları Fotokupi boyutu, spektral duyarlılık, kinetik ve katyon seçiciliği mevcuttur. Nörobilimde, CCR'lerHücreleri harekete geçirmek ve AP'leri tetiklemek için kullanıldığında ışık tahrikli mikrobiyal pompalar yıllardır nöronları susturmak için mevcut tek antagonistti. 2014'te, iki grup aynı anda CCR'lerin, moleküler mühendislik 9 , 21 aracılığıyla varsayılan iyon iletken gözenek boyunca polaritenin değiştirilmesi yoluyla anyon ileten kanalrodopsinlere (ACR'ler) dönüştürülebileceğini gösterdi. Daha sonra doğal ACR'ler birkaç kriptofit alg içinde tanımlandı 22 , 23 , 24 . En önemlisi, ACR'lerin hafif aktivasyonu, erişkin nöronlardaki klorür akımlarına aracılık eder ki, emilen foton başına yalnızca tek yükleri taşıyan mikrobik pompalardan çok daha düşük ışık yoğunluklarında nöronal aktivitenin engellenmesine izin verir.
ChR aktivitesi doğrudan HEK293 hücrelerindeki ışık kaynaklı akımların elektrofizyolojik yama-klemp kayıtları ile ele alınabilir. Yama kelepçesiTekniği başlangıçta 1970'lerin sonlarında geliştirildi ve Hamill ve ark. Tarafından daha da geliştirildi . , Yüksek akım çözünürlüğü ve membran voltajının doğrudan kontrolü ile küçük bir hücreden (bütün hücre modu) akımların varlığının kayıt edilmesine izin verir 26 . Hücre kültürüne uygulanan bu teknik, iyonik ve elektrik kayıt koşullarını doğru bir şekilde kontrol eder ve iyon seçiciliğinin yanı sıra toplam akımın iyonların görece katkısı ile çalışılmasını sağlar. Burada, Proteomonas sulcata'nın ( Ps ACR1) 22 , 23'ün anyon iletken kanal rehidopsiyonu için iyon seçiciliğinin incelenmesini, yüksek klorür iletkenliğini kanıtlamak için çeşitli hücre dışı klorür konsantrasyonları altındaki akım-voltaj ilişkilerinin kaydı inceleyerek örnekleyeceğiz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tanımlanmış iyonik ve elektrik koşullarındaki ters potansiyellerin saptanması, ChRs'in ışık aktivasyonu sonrasında taşınan iyon türleri hakkında bilgi verir. Tek bir iyon türü karmaşık bir fizyolojik ortamda çeşitlenirse ve elde edilen ters potansiyel teorik Nernst potansiyeline göre değişirse, bu iyon türü taşınan tek sayıdır.
Bununla birlikte, ChR'ler için, ters potansiyel kaymalar, farklı iyonik türlere geçirgenlik ve ayrıca iletken iyonlar arası…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mükemmel teknik yardım için Maila Reh, Tharsana Tharmalingam ve özellikle Altina Klein'e teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Alman Araştırma Vakfı (DFG) (SFB1078 B2, PH için FOR1279 SPP1665) ve Kataliz, UniCat, BIG-NSE (JV) ve E4 (PH) Kavramlarını Birleştiren Kümeler tarafından desteklendi.
Materials
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E.coli/ | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E.coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
References
- Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle. Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Li, X., et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).
- Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).
- Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), 409-412 (2014).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).
- Tsunoda, S. P., Hegemann, P. Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation. Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).
- Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. Ion selectivity and competition in channelrhodopsins. Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).
- Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride. MBio. 2 (3), 1-9 (2011).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis. J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).
- Hou, S. -. Y., et al. Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins. Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).
- Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a., Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).
- Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel. Science. 344 (6182), 420-424 (2014).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin. Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).
- Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata. J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
- Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).
- Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
- Amtmann, A., Sanders, D. A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes. J. Exp. Bot. 48, 361-364 (1997).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. Using microelectrodes. Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).
- Prigge, M., et al. Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics. J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).
- Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. Rectification of the channelrhodopsin early conductance. Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
- Wietek, J., Prigge, M. Enhancing Channelrhodopsins: An Overview. Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).
- Ferenczi, E. A., et al. Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability. Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).
- Sugiyama, Y., et al. Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2. Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).
- Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).
- Wang, H., et al. Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas. J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).
- Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).
- Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).
