체외 시스템의 신진 대사 능력은 약물 및 독성 물질의 생체 내 변화 및 처분을위한 핵심 요구 사항입니다. 이러한 프로토콜에서는, I는 세포 배양 대사 위상을 평가하기위한 기준 대사 프로브의 적용을 설명한다.
생체이 대사 효소는 용해도를 증가 및 배설을 촉진 작용기를 첨가하여 약제의 독성 물질 및 생물 전환에 중요한 기능을 담당한다. 어떤 경우에 그 구조 변경은 새로운 독성 제품의 형성으로 이어질. 동물 실험을 줄이기 위해, 화학적 위험은 대사 능력이 세포를 이용하여 평가 될 수있다. 대사 효소의 발현은, 그러나, 체외 차 문화 시스템에서 많은 시간 이상 안정되지 종종 세포 라인의 일부 또는 존재하지 않는다. 따라서, 생체 외 의약품, 첨가제, 환경 오염 물질 대사의 연구는 이상적으로 신진 대사 활동이 특징되었습니다 전지 시스템에서 수행되어야한다. 우리는 UPLC 질량 분석에 의한 정량적 화학 프로브 및 대사 제품을 사용하여 2D 세포주 및 기본 3D의 문화 대사 효소의 클래스의 활동 (인간 단계 I)를 측정하기 위해 여기에 방법을 설명하고luminometry. 방법 세포주 및 다양한 조직으로부터 유도 된 세포의 주 대사 활성을 테스트하도록 구현 될 수있다.
생체이 대사는 신체 외부 화학 물질들이 배출을 용이하게 한 친수성기와 복합체의 첨가에 의해 수정되는 과정이다. 일반적으로 생체 이물질의 대사 제가 하나 이상의 수산기 (1, 2)의 첨가와 함께 산화 주로 이루어지는 단계와 두 단계 프로세스이다. 예컨대 글루 쿠로 니드 또는 황산 부분 (1, 2)과 같은 친수성 복합체에 대한 수용체로서 단계 II에서, 수산기가 사용된다. 셉터 그룹이 이미 분자에 존재하는 경우, 접합 공정 독립적 I 상 대사 일어날 수있다. 각 화학 반응 기판 (3)의 특정 효소의 기, 예를 들어, 히드 록 실화를 촉매 CYPs (시토크롬 P450s) (도 1), 탈 알킬화에 의해 수행된다. ConjugatioN sulfotransferases에 의해 촉매되는, UDP-glucuronosyltransferases (도 1), 글루타티온 S 트랜스퍼 – 및 N- 아세틸 트랜스퍼 4. 각 조직 및 기관은 그 대부분의 단백질을 발현시키는 간암으로 특정 대사 효소의 발현 프로파일을 가질 것이다.
그림 1 : 단계 I와 쿠마린을위한 단계 II 대사의 예. CYP2A6은 / 쿠마린의 7 수산화을 촉진 CYP2A13. 7- 하이드 록시 쿠마린이 UGT1A6 및 UGT1A9 가장 높은 활성을 보여주는, 단계 II 효소에 의한 글루 쿠 UGTs 잔기에 접합된다.
생체 이물질의 신진 대사를 이해하는 것은 두 가지 이유에 대한 약물 안전성 평가 및 화학 위험 평가에 중요한 : 반응 속도론은 약물이나 화학 물질은 활성 또는 비활성 형태 B의 몸에 남아 시간을 결정합니다는 efore 배설; 및 모 화합물 대사 효소에 의해 더 반응성 불안정한 독성 종으로 변형 될 수있다. 또한 "생리 활성"로 알려진 이러한 반응은 대부분 내가뿐만 아니라 상 II 결합 (5)에 의해 희소 한 경우에 효소를 CYP 단계에 의해 구동된다.
이를 바탕으로 정확하게 약물이나 화학 물질과 관련된 위험을 예측하는 체외 모델의 능력은 전지 시스템의 신진 대사 능력에 크게 의존한다. 병든 조직 또는 정상 세포의 변형 유래 세포주에 종종 부분 아니라면 원점 (6)의 이들 조직의 대사 효소 프로필 대표 모두 잃는다. 정상 대사 효소 프로파일의 유지는 (적어도 단기간 배양)에서 일차 세포 배양 물에 잘 나타나 조직이 그것의 3 차원 구조 (1)를 유지할 수 있도록 매트릭스 배양 할 경우 더욱 향상된다. 따라서 문자체외 전지 시스템의 신진 대사 능력의 acterization 세포 모델은 화학 물질 안전성 평가를 수행 할 적절한에 관한 결정을 안내하는 중요한 예비 단계입니다.
본 연구에서 우리는 간 세포주 7 3D 차 폐암 세포 배양 8 애플리케이션의 예는 시험관 내에서의 활성 및 단계 I CYP 효소의 발현을 프로필에 대한 프로토콜을 제시한다. CYP 특정 기질 대사 억제제 제품 및 컨트롤 질량 spectrometry- 및 luminogenic 기반 정량 방법과 함께 설명한다. 일부 CYPs을 유도하고 다른 구성적인 때문에, 예는 그 두 가지 시나리오에 대해 구체적으로 살펴 보도록한다.
현재, 많은 표준화 된 독성 시험 시스템은 정상적인 인간의 신진 대사 하나의 대표하지 않습니다 엔지니어링 세균, 세포 선, 또는 배아 세포를 사용합니다. 이것은 화학 물질 또는 약의 잠재적 인 독성 활동의 부정확 한 예측으로 이어질 수 있습니다. 이러한 칩 3D 세포 배양 및 장기 등의 생체 외 모델의 혁신적인 개선 인체 조직 21, 22, 23의 일반적인 형태 및 대사 활성을 복제하기위한 시도로 개발되고있다. 대사 능력 모델이 가장 독성 약물 평가 및 연구에 적합한 생물 전환 된 해독하는데 사용될 수있는 하나 개의 기준이다.
우리는이 논문에서 설명했다 프로토콜은 살아있는 세포를 사용하여 CYP 효소의 활동을 측정하도록 설계되었습니다. 그것은 유연하고 2D 또는 3D이 배양 다른 전지 시스템에 사용할 수 있습니다ES와 luminogenic 프로브 – 또는 질량 분석 기반 접근 방식을 사용 할 수있는 옵션을 제공합니다. 두 가지 방법은 재료의 나노 그램 수량을 감지하고 만 다공 형태로 성장하는 소수의 세포를 필요로 할만큼 민감하다. 또한 회전 타원체에 적용 할 수 또는 세포는 복잡한 매트릭스에서 재배. 프로브 기판의 선택은 분명 프로토콜의 중요한 요소이다. 상기 분석의 특이성은 선택적 CYP 억제제의 사용에 의해 얻어 질 수 CYP 효소 보증 다른 층의 선택적 인 프로브에 의존한다. 기판 및이 문서에 나와 억제제는 몇 가지 예에 불과하지만, 다른 사람은 문헌에서 찾을 수 있습니다.
이 효소는 낮은 수준으로 발현되는 것에 기인 할 수있는 네거티브 CYP 활성 결과로서 새로운 세포 유형으로 작동 할 때 복수의 배양 시간을 고려하는 것이 중요하다. 양성 대조군으로 사용할 수있는 세포 유형의 추가한다는 보장하는 것이 바람직부정적인 결과는 기술적 인 문제에 어떤 문제 해결에 도움이 연결되지 않습니다. 주 간 세포가 대사 능력이 서스펜션 예를 차 간세포를 들어, 대조군으로 사용 할 수있는 것은 매우 쉽게 쓸 수 있지만 그들의 생존은 시간에 제한됩니다. 간 세포 라인이 프로토콜에 설명 된대로 사용하는 것이 상대적으로 용이 가능한 대안이지만, 일부는 신진 대사 활동 (6), (21)의 측면에서 다른 사람보다 더 낫다.
분석은 총 단백질 정량되지 않는 비 파괴적이기 때문에, 종 공부 (20)에 시간 경과 CYP 활성을 수행 할 수있다. 일부 세포는 배양 시간이 지남에 따라 변수 CYP 활동을하고 있기 때문에 이것은 중요한 포인트입니다. 음의 결과는 시험관 내에서 분화 또는 탈분화로 포화 상태의 부족, 진행과 연관 될 수 있습니다. 이 경우, 접근 방식은 반 quantitati입니다데이터는 각각의 세포 배양 물에서 단백질의 총량에 의해 정규화되지 않으므로했습니다. TCDD의 경우와 같이 조직에 대한 독성 효과를 가질 수있는 프로브, 억제제 또는 유도 물질에 대한 노출로 CYP 활성을 측정 한 후, 조직을 재사용하는 것이 불가능하거나 바람직하지 않습니다.
같은 마이크로 솜 같은 셀 분수는 주어진 세포 유형의 CYP 활동을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 미크로 제제는, 그러나, 셀 재 적절한 보조 인자의 첨가 많이 필요하고, 효소 활성을 유지하도록 버퍼. 살아있는 세포를 사용하여 까다로운 마이크로 좀의 준비 단계를 제거하고 버퍼링 공동 인자가 가장 잘 작동하는 운동.
일반적인 추천 정보로서, 추가로이 효소 활성과 일치하는지 확인하는 세포 배양에서 CYPs의 발현 프로파일을 특성화하기위한 가장 좋은 방법이다. 검증이 추가 레벨은 신진 대사 프로브는 enti되지 않습니다 주어진 권장단일 CYP 특정 의존하며 측정 된 대사 활성은 해당 효소의 발현에 의해 일치 증가 된 신뢰도를 제공한다. CYPs 멤브레인 단백질이기 때문에 그러므로 그들은 정량적 RT-PCR이 효소 20 프로파일에 바람직한 접근왔다 웨스턴 블랏을 준비하기 위해 상대적으로 어렵다.
이 프로토콜은 단지 하나의 중요한이라도 대사 효소 패밀리 중 하나를 나타내는 분석 CYP 효소 활성에 대한 방법을 설명하는 것이 중요하다. 질량 분광 분석 방법의 유연성은 프로브 기판의 다른 대사 변환에 대한 취득 방법의 개발을 허용한다. 그러나, 그것들은 한번에 하나씩 개발되어야 할 현재 공지 적은 특정 프로브 및 다른 대사 효소 군에 대한 선택적 억제제가있다. 이 격차는 체외 세포 등산용의 신진 대사 능력의 종합적인 평가를 할 수 있도록 해결해야MS.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.
Reagent & Cells | |||
2 μm syringe filter | Whatman | UN203NPEORG | |
24 well plate | Corning | 3524 | |
4-methylumbelliferone | Sigma Aldrich | M1381 | |
5-phenyl pentyne | Sigma Aldrich | CD5001437 | |
6-hydroxybupropion | Sigma Aldrich | H3167 | |
6-hydroxychlorzoxazone | Sigma Aldrich | UC148 | |
7-ethoxycoumarin | Sigma Aldrich | 195642 | |
7-hydroxycoumarin | Sigma Aldrich | H24003 | |
8-methoxypsoralen | Sigma Aldrich | M3501 | |
acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
acetonitrile | Fisher | A/0626/17 | |
α-naphthoflavone | Sigma Aldrich | N5757 | |
BCA kit | Thermo Scientific | 23227 | |
b-glucuronidase/arylsulfatase | Sigma Aldrich | G0876 | |
Bupropion | Sigma Aldrich | B102 | |
Carbamazepine | Sigma Aldrich | C4024 | |
chlorzoxasone | Sigma Aldrich | C4397 | |
collagen | Cell Systems | 5005-B | |
coumarin | Sigma Aldrich | C4261 | |
disulfiram | Sigma Aldrich | 86720 | |
fluvoxamine | Sigma Aldrich | F2802 | |
Glutamax (Glutamine supplement) | Fisher | 35050061 | |
HepaRG metabolism supplement | Merck | MMAD621 | |
HepaRG thaw media supplement | Merck | MMADD671 | |
HepaRG | Merck | MMHPR116 | |
Luciferin-CEE | Promega | V8751 | |
methanol | Fisher | M/4056/17 | |
MucilAir airway cells | Epithelix | EP01 | |
MucilAir airway cells maintenance media | Epithelix | EP04MM | |
Phenomenex Kinetex 2.6μm, PFP 100A | Phenomenex | 00B-4477-AN | |
TCDD | Sigma Aldrich | 48599 | |
thioTEPA | Sigma Aldrich | T6069 | |
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8µm 2.1 x 50mm | Waters | 86003538 | |
Williams’ E media | Fisher | 17704-024 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
UPLC | Waters | Acquity | |
QTRAP MS | Sciex | ABI Sciex 4000 | |
QTRAP MS software | Sciex | Analyst 1.4.2 | |
luminometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
cell counter | Beckman Coulter | Vi-Cell XR | |
rotary evaporator | Eppendorf | Eppendorf-5301 |