Metabolsk kompetansen av in vitro-systemer er en viktig forutsetning for biotransformasjonen og disponering av narkotika og giftstoffer. I denne protokollen beskriver vi anvendelse av referanse metabolske prober for å vurdere fase I metabolisme i cellekulturer.
Xenobiotiske metaboliserende enzymer spiller en nøkkelfunksjon i biotransformasjonen av medisiner og giftstoffer ved tilsetning av funksjonelle grupper som øker oppløseligheten og letter utskillelsen. I noen tilfeller er disse strukturelle endringer føre til dannelse av nye giftige produkter. For å redusere dyreforsøk, kan kjemisk risiko vurderes ved hjelp av metabolsk kompetente celler. Ekspresjon av metabolske enzymer, men er ikke stabil over tid i mange in vitro-primærkultursystemer og er ofte delvis eller fraværende i cellelinjer. Derfor bør studiet av legemidler, additiver, og miljøgifter metabolisme in vitro ideelt sett være utført i cellesystemer hvor stoffskifteaktivitet er blitt karakterisert. Vi forklarer her en metode for å måle aktiviteten til en klasse av metabolske enzymer (human fase I) i 2D-cellelinjer og primære 3D-kulturer ved anvendelse av kjemiske sonder og deres metabolske produkter kvantifiserbare ved UPLC massespektrometri ogluminometry. Fremgangsmåten kan implementeres for å teste den metabolske aktiviteten i cellelinjer og primære celler avledet fra en rekke forskjellige vev.
Xenobiotisk metabolisme er den prosessen som kjemikalier som er fremmede for legemet blir modifisert ved tilsetning av hydrofile grupper og konjugater for å lette deres utskillelse 1. Typisk metabolismen av xenobiotika er en to-trinns prosess med fase I som består hovedsakelig av en oksydasjon med tillegg av en eller flere hydroksylgrupper 1, 2. I fase II, blir hydroksylgruppene brukt som akseptorer for en hydrofil konjugat slik som glukuronid eller en sulfatgruppe 1, 2. Dersom en akseptor-gruppen allerede er tilstede i molekylene, kan det konjugeringstrinn skje uavhengig av fase I metabolisme. Hver reaksjon blir utført ved hjelp av en spesifikk gruppe enzymer, for eksempel, CYPs (cytokrom P450'er), som katalyserer hydroksylering (figur 1) og dealkylering av kjemiske substrater 3. Conjugation blir katalysert av sulfotransferaser, UDP-glukuronosyltransferaser (figur 1), glutation-S-transferaser og N-acetyltransferases 4. Hvert vev og organ vil ha en bestemt metabolsk enzym ekspresjonsprofilen, med leveren for å uttrykke de fleste av disse proteiner.
Figur 1: Eksempel på fase I og fase II Metabolism til Coumarin. CYP2A6 / CYP2A13 katalysere 7-hydroksylering av kumarin. 7-hydroxykumarin er konjugert til en glukuronid resten ved fase II-enzymer UGTs, med UGT1A6 og UGT1A9 som viser den høyeste aktivitet.
Forståelse metabolismen av xenobiotika er kritisk i evalueringen av narkotika sikkerhet og for kjemisk risikovurdering av to grunner: reaksjonskinetikkene vil bestemme hvor lenge et medikament eller kjemiske vil forbli i kroppen i en aktiv eller inaktiv form before utskillelse; og stamforbindelsen kan modifiseres til en mer reaktiv, ustabil og toksiske art av metabolske enzymer. Slike reaksjoner også kjent som "bioaktivering" er for det meste drevet av fase I-CYP-enzymer, men også på mer sjeldne anledninger av fase II konjugering 5.
Basert på dette ble evnen til en in vitro modell for å forutsi risikoen forbundet med et medikament eller et kjemisk er svært avhengig av den metabolske kompetansen av cellesystemet. Cellelinjer avledet fra syke vev eller fra transformasjonen av normale celler ofte miste en del om ikke alle av de metabolske enzym profilen er representative for deres vev opprinnelses 6. Opprettholdelsen av den normale metabolske enzym profil vises bedre i primære cellekulturer (i det minste i korte tidskulturer) og blir ytterligere forbedret dersom vevet er dyrket i en matrise slik at den beholder sin 3D-struktur en. Derfor røyeacterization av metabolsk kompetansen av et in vitro cellesystem er et viktig innledende trinn i styring av beslutningen om hvilken cellemodell er hensiktsmessig å gjennomføre kjemiske sikkerhetsvurderinger.
I denne artikkelen presenterer vi en protokoll for å profilere aktivitet og ekspresjon av fase I CYP-enzymer in vitro med eksempler på deres anvendelse med en levercellelinje 7 og 3D primær lungecellekulturer 8. CYP spesifikke substrater, deres metabolske produkter og inhibitor kontroll er beskrevet sammen med massen spectrometry- og luminogenic-baserte kvantifisering metoder. Siden noen CYPs er induserbar og andre er konstituerende, vil eksempler også bli gitt for de to scenariene.
For tiden er mange standardiserte toksikologiske testsystemer som bruker konstruerte bakterier, cellelinjer, eller embryonale celler som ikke er representative for den normale humane metabolisme 1. Dette kan føre til unøyaktige prediksjonene av den potensielle toksiske aktivitet av en kjemisk eller medisin. In vitro-modeller, slik som 3D-cellekulturer og organ på en brikke, blir utviklet i et forsøk på å bedre gjenskape normal morfologi og metabolsk aktivitet i humant vev 21, 22, 23. Metabolsk kompetanse er et kriterium som kan brukes til å dechiffrere hvilke modeller som er best egnet for toksikologiske vurdering og narkotika biotransformasjonsprodukter studier.
Protokollen har vi beskrevet i denne artikkelen er konstruert for å måle aktiviteten til CYP-enzymer ved hjelp av levende celler. Den er fleksibel og kan brukes til forskjellige cellesystemer i 2D eller 3D cultures og tilbyr muligheten til å bruke enten en luminogenic sonde og eller massespektrometri basert tilnærming. Begge metodene er følsom nok til å detektere nanogram-mengder av stoffer, og bare krever et lite antall celler dyrket i et multibrønnformat. De kan også bli brukt for å, sfæroide eller cellene dyrkes i komplekse matriser. Utvelgelsen av sonden substratet er åpenbart en viktig del av protokollen. Spesifisiteten av analysen er avhengig av proben er selektivt av CYP-enzym og et annet lag av sikkerhet kan oppnås ved anvendelse av en selektiv CYP inhibitor. De substrater og inhibitorer som er oppført i dette papir er bare noen få eksempler, men andre kan bli funnet i litteraturen.
Det er viktig å vurdere flere inkubasjonstider når man arbeider med en ny celletype som et negativt resultat CYP aktivitet kan skyldes enzymet som uttrykkes på et lavt nivå. Tilsetningen av en celletype som kan benyttes som en positiv kontroll er tilrådelig for å sikre at ennegativt resultat er ikke knyttet til et teknisk problem, og for å hjelpe med eventuelle feilsøking. Primære leverceller er metabolsk kompetent og kan brukes som kontroll, for eksempel primære hepatocytter i suspensjonen er meget enkelt å bruke, men deres levedyktighet er begrenset i tid. Levercellelinjer er mulige alternativer som er forholdsvis enkle å bruke som er beskrevet i denne protokollen, men noen er bedre enn andre i form av metabolsk aktivitet til 6, 21.
Siden analysen er ikke-destruktiv, med mindre total-protein kvantifiseres, er det mulig å følge CYP-aktivitet over tid i longitudinelle studier 20. Dette er et viktig poeng fordi noen celler vil ha variabel CYP aktivitet over tid i kultur. Et negativt resultat kan være forbundet med mangel på konfluens fremskritt med differensiering eller dedifferensiering in vitro. I så fall, er problemstillingen semi-quantitative siden dataene ikke normaliseres av den totale mengden av protein i hver cellekultur. Det er ikke alltid mulig eller anbefalt å gjenbruke vev etter måling av CYP aktivitet som eksponering til prober, hemmere eller induktorer kan ha en toksisk virkning på vev som er tilfellet for TCDD.
Cellefraksjoner slik som mikrosomer kan også benyttes for å karakterisere CYP aktiviteten til en gitt celletype. Mikrosomekstrakter preparater krever imidlertid mye av cellemateriale, tilsetning av tilstrekkelig kofaktorer og buffer for å sikre at enzymene som forblir aktiv. Ved hjelp av levende celler eliminerer vanskelig micro forberedelse trinn og arbeider ut hvilke buffere og kofaktorer fungerer best.
Som en generell anbefaling, er det en god fremgangsmåte for å karakterisere videre ekspresjonsprofilen av CYPs i cellekulturer for å bekrefte at det samsvarer med enzymatisk aktivitet. Denne ekstra nivå av verifiserings anbefales gitt at de metabolske probene ikke er entiavhengige spesifikke for en enkelt CYP og det gir større tillit til at den målte metabolske aktiviteten er avstemt med det tilsvarende enzym uttrykk. Siden CYPs er membranproteiner de er forholdsvis vanskelig å fremstille for Western blot, derfor kvantitativ RT-PCR har vært den foretrukne metode for å profilere disse enzymer 20.
Det er viktig å merke seg at denne protokollen beskriver en metode for å analysere med CYP-enzymaktiviteten som bare representerer en familie av metabolske enzymer, selv om den er viktig. Fleksibiliteten av en massespektrometri løsning tillater utvikling av innsamlingsmetode for andre metabolske transformasjoner av prøvesubstrater. Men de har til å bli utviklet en om gangen, og det er for tiden færre kjente spesifikke prober og selektive inhibitorer for andre metabolske enzymfamilier. Dette gap bør tas opp for å tillate en fullstendig vurdering av den metabolske kompetansen av in vitro celle systems.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.
Reagent & Cells | |||
2 μm syringe filter | Whatman | UN203NPEORG | |
24 well plate | Corning | 3524 | |
4-methylumbelliferone | Sigma Aldrich | M1381 | |
5-phenyl pentyne | Sigma Aldrich | CD5001437 | |
6-hydroxybupropion | Sigma Aldrich | H3167 | |
6-hydroxychlorzoxazone | Sigma Aldrich | UC148 | |
7-ethoxycoumarin | Sigma Aldrich | 195642 | |
7-hydroxycoumarin | Sigma Aldrich | H24003 | |
8-methoxypsoralen | Sigma Aldrich | M3501 | |
acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
acetonitrile | Fisher | A/0626/17 | |
α-naphthoflavone | Sigma Aldrich | N5757 | |
BCA kit | Thermo Scientific | 23227 | |
b-glucuronidase/arylsulfatase | Sigma Aldrich | G0876 | |
Bupropion | Sigma Aldrich | B102 | |
Carbamazepine | Sigma Aldrich | C4024 | |
chlorzoxasone | Sigma Aldrich | C4397 | |
collagen | Cell Systems | 5005-B | |
coumarin | Sigma Aldrich | C4261 | |
disulfiram | Sigma Aldrich | 86720 | |
fluvoxamine | Sigma Aldrich | F2802 | |
Glutamax (Glutamine supplement) | Fisher | 35050061 | |
HepaRG metabolism supplement | Merck | MMAD621 | |
HepaRG thaw media supplement | Merck | MMADD671 | |
HepaRG | Merck | MMHPR116 | |
Luciferin-CEE | Promega | V8751 | |
methanol | Fisher | M/4056/17 | |
MucilAir airway cells | Epithelix | EP01 | |
MucilAir airway cells maintenance media | Epithelix | EP04MM | |
Phenomenex Kinetex 2.6μm, PFP 100A | Phenomenex | 00B-4477-AN | |
TCDD | Sigma Aldrich | 48599 | |
thioTEPA | Sigma Aldrich | T6069 | |
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8µm 2.1 x 50mm | Waters | 86003538 | |
Williams’ E media | Fisher | 17704-024 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
UPLC | Waters | Acquity | |
QTRAP MS | Sciex | ABI Sciex 4000 | |
QTRAP MS software | Sciex | Analyst 1.4.2 | |
luminometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
cell counter | Beckman Coulter | Vi-Cell XR | |
rotary evaporator | Eppendorf | Eppendorf-5301 |