Metabolic kompetens in vitro-system är en viktig förutsättning för biotransformeringen och disposition av droger och gifter. I detta protokoll beskriver vi tillämpningen av referens metaboliska sönder för att bedöma fas I metabolism i cellodlingar.
Xenobiotiska metaboliserande enzymer spelar en nyckelfunktion i biotransformeringen av läkemedel och gifter genom att lägga till funktionella grupper som ökar löslighet och underlättar utsöndring. Vid vissa tillfällen de strukturella förändringar leder till bildandet av nya giftiga produkter. I syfte att minska djurförsök, kan kemisk risk bedömas med användning av metaboliskt kompetenta celler. Expressionen av metaboliska enzymer är emellertid inte stabil över tid i många i primär kultur vitro-system och är ofta partiell eller frånvarande i cellinjer. Därför bör studier av läkemedel, tillsatser, och miljöföroreningar metabolism in vitro idealt utföras i cellsystem där metabolisk aktivitet har karakteriserats. Vi förklarar här en metod för att mäta aktiviteten av en klass av metabola enzymer (Human fas I) i 2D cellinjer och primära 3D kulturer med hjälp av kemiska prober och deras metaboliska produkter mätbara av UPLC masspektrometri ochluminometri. Metoden kan genomföras för att testa den metaboliska aktiviteten i cellinjer och primära celler härledda från en mängd olika vävnader.
Xenobiotisk metabolism är den process genom vilken kemikalier som är främmande för kroppen modifieras genom tillsats av hydrofila grupper och konjugat för att underlätta deras utsöndring 1. Typiskt metabolismen av xenobiotika är en två-stegsprocess med fas I består mestadels av en oxidation med tillsats av en eller flera hydroxylgrupper 1, 2. I fas II, är hydroxylgrupperna används som acceptorer för en hydrofil konjugat såsom glukuronid eller ett sulfatgrupp 1, 2. Om en acceptor grupp redan finns på molekylerna, kan konjugeringssteget hända oberoende av fas I-metabolism. Varje reaktion utförs av en specifik grupp av enzymer, t ex CYP (cytokrom P450-er), som katalyserar hydroxylering (Figur 1) och dealkylering av kemiska substrat 3. Conjugation katalyseras av sulfotransferaser, UDP-glukuronosyltransferaser (figur 1), glutation-S-transferaser och N-acetyltransferaser 4. Varje vävnad och organ kommer att ha en viss metabolisk enzymuttrycksprofil, med levern uttrycker de flesta av dessa proteiner.
Figur 1: Exempel på fas I och fas II Metabolism för Kumarin. CYP2A6 / CYP2A13 katalysera 7-hydroxylering av kumarin. 7-hydroxikumarin är konjugerad till ett glukuronidenheten genom fas II enzymer UGT, med UGT1A6 och UGT1A9 som visar den högsta aktiviteten.
Förstå metabolism av xenobiotika är kritisk i utvärderingen av läkemedelssäkerhet och för riskbedömning kemikalier av två skäl: reaktionskinetiken kommer att avgöra hur länge ett läkemedel eller kemisk blir kvar i kroppen i en aktiv eller inaktiv form Böre utsöndring; och moderföreningen kan modifieras till en mer reaktiv, instabil och toxiska species av metaboliska enzymer. Sådana reaktioner även känd som "bioaktivering" är mestadels drivna av fas I CYP-enzymer utan även på mer sällsynta tillfällen av fas II konjugering 5.
Baserat på detta, är förmågan hos en in vitro-modell för att exakt förutsäga den risk som är förknippad med ett läkemedel eller en kemikalie som är mycket beroende av den metaboliska kompetensen hos cellsystemet. Cellinjer härledda från sjuka vävnader eller från transformation av normala celler förlorar ofta en del om inte alla av den metaboliska enzymprofil representativ för deras ursprungsvävnad 6. Bibehållande av den normala metaboliska enzymprofil visas bättre i primära cellkulturer (åtminstone i korttidskulturer) och förbättras ytterligare om vävnaden odlas i en matris så att den kan bibehålla sin 3D-struktur 1. Därför, det förkolnadeacterization av den metaboliska kompetensen i ett in vitro-cellsystem är ett viktigt preliminärt steg för att vägleda beslutet om vilken cell modell är lämpligt att göra kemiska säkerhetsutvärderingar.
I detta dokument presenterar vi ett protokoll för att profilera aktivitet och uttryck av fas I CYP-enzymer in vitro med exempel på deras tillämpning med en hepatisk cellinje 7 och 3D primära lungcellkulturer 8. CYP specifika substrat, deras metaboliska produkter och inhibitor kontroller beskrivs tillsammans med mass spectrometry- och luminogena baserade kvantifieringsmetoder. Eftersom vissa CYP är inducerbara och andra är konstitutiva kommer exempel också ges för dessa två scenarier.
För närvarande många standardiserade toxikologiska testsystem använder Engineered bakterier, cellinjer eller embryonala celler som inte är representativa för den normala humana metabolismen 1. Detta kan leda till felaktiga förutsägelser om potentiella toxiska aktiviteten hos en kemisk eller medicin. Innovativa in vitro modeller, såsom 3D-cellkulturer och organ på ett chip, håller på att utvecklas i ett försök att bättre replikera normal morfologi och metabolisk aktivitet hos mänskliga vävnader 21, 22, 23. Metabolic kompetens är ett kriterium som kan användas för att dechiffrera vilka modeller är bäst lämpade för toxikologisk bedömning och läkemedelsmetabolismen studier.
Protokollet vi har skisserat i detta dokument är utformad för att mäta aktiviteten av CYP-enzymer med hjälp av levande celler. Den är flexibel och kan användas för olika cellsystem i 2D eller 3D cultures och ger möjlighet att använda antingen en luminogent probe- eller masspektrometri baserat tillvägagångssätt. Båda metoderna är tillräckligt känsliga för att detektera nanogrammängder av material och endast kräver ett litet antal celler odlade i en flerbrunnsformat. De kan också tillämpas på sfäroid eller celler odlas i komplexa matriser. Valet av sonden substratet är uppenbarligen ett kritiskt element av protokollet. Specificiteten hos analysen förlitar sig på sonden vara selektiv för CYP enzymet och ett annat skikt av säkerhet kan erhållas genom användning av en selektiv CYP inhibitor. Substraten och hämmare som anges i detta dokument är bara några exempel, men andra kan hittas i litteraturen.
Det är viktigt att beakta flera inkubationstider vid arbete med en ny cell som ett negativt CYP-aktivitet resultat skulle kunna bero på det enzym som uttrycks på en låg nivå. Tillsatsen av en celltyp som kan användas som en positiv kontroll är tillrådligt att säkerställa att ennegativt resultat är inte kopplad till en teknisk fråga och att hjälpa till med felsökning. Primära leverceller är metaboliskt kompetenta och kan användas som kontroll, till exempel primära hepatocyter i suspension är mycket lätt att använda, men deras livskraft är begränsad i tid. Levercellinjer är möjliga alternativ som är relativt lätt att använda som beskrivs i detta protokoll, men vissa är bättre än andra när det gäller metabolisk aktivitet 6, 21.
Eftersom analysen är icke-förstörande, om inte totalt protein kvantifieras, är det möjligt att följa den CYP-aktivitet över tid i longitudinella studier 20. Detta är en viktig punkt eftersom vissa celler kommer att ha variabel CYP aktivitet över tiden i kultur. Ett negativt resultat kan vara förknippade med bristen på sammanflytning, framsteg med differentiering eller avdifferentiering in vitro. I så fall är den metod halv quantitative eftersom data inte är normaliserad med den totala mängden protein i varje cellkultur. Det är inte alltid möjligt eller rekommenderat att återanvända vävnaden efter mätning av CYP aktivitet som exponering för sonder, hämmare eller inducerare kan ha en toxisk effekt på vävnaden som är fallet för TCDD.
Cellfraktioner såsom mikrosomer skulle också kunna användas för att karakterisera den CYP-aktivitet av en given celltyp. Mikrosomberedning kräver emellertid en hel del cellmaterial, tillsättning av lämpliga kofaktorer och buffert för att säkerställa att de enzymer förblir aktiva. Med hjälp av levande celler eliminerar knepiga mikros förberedelse steg och träna som buffrar och kofaktorer fungerar bäst.
Som en allmän rekommendation, är det bästa praxis för att ytterligare karakterisera uttrycksprofilen av CYP i cellkulturer för att verifiera att den matchar den enzymatiska aktiviteten. Denna extra nivå av verifiering rekommenderas med tanke på att de metaboliska sond inte Entiförlita specifika för en enda CYP och det ger ökad förtroende för att den uppmätta metabolisk aktivitet motsvaras av motsvarande enzym-expression. Eftersom CYP är membranproteiner är de relativt svåra att framställa för western blöts, därför kvantitativ RT-PCR har varit det föredragna tillvägagångssättet att profilera dessa enzymer 20.
Det är viktigt att notera att detta protokoll beskriver en metod för att analysera CYP enzymaktivitet som endast representerar en familj av metaboliska enzymer, om än en viktig sådan. Flexibiliteten i en mass tillvägagångssätt spektrometri tillåter utvecklingen av anskaffningsmetoder för andra metabola omvandlingar av probsubstrat. Men de har utvecklas en i taget och det finns för närvarande färre kända specifika prober och selektiva inhibitorer för andra metabola familjer enzym. Detta gap bör åtgärdas för att möjliggöra en övergripande bedömning av den metaboliska kompetensen hos in vitro cell systeFröken.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.
Reagent & Cells | |||
2 μm syringe filter | Whatman | UN203NPEORG | |
24 well plate | Corning | 3524 | |
4-methylumbelliferone | Sigma Aldrich | M1381 | |
5-phenyl pentyne | Sigma Aldrich | CD5001437 | |
6-hydroxybupropion | Sigma Aldrich | H3167 | |
6-hydroxychlorzoxazone | Sigma Aldrich | UC148 | |
7-ethoxycoumarin | Sigma Aldrich | 195642 | |
7-hydroxycoumarin | Sigma Aldrich | H24003 | |
8-methoxypsoralen | Sigma Aldrich | M3501 | |
acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
acetonitrile | Fisher | A/0626/17 | |
α-naphthoflavone | Sigma Aldrich | N5757 | |
BCA kit | Thermo Scientific | 23227 | |
b-glucuronidase/arylsulfatase | Sigma Aldrich | G0876 | |
Bupropion | Sigma Aldrich | B102 | |
Carbamazepine | Sigma Aldrich | C4024 | |
chlorzoxasone | Sigma Aldrich | C4397 | |
collagen | Cell Systems | 5005-B | |
coumarin | Sigma Aldrich | C4261 | |
disulfiram | Sigma Aldrich | 86720 | |
fluvoxamine | Sigma Aldrich | F2802 | |
Glutamax (Glutamine supplement) | Fisher | 35050061 | |
HepaRG metabolism supplement | Merck | MMAD621 | |
HepaRG thaw media supplement | Merck | MMADD671 | |
HepaRG | Merck | MMHPR116 | |
Luciferin-CEE | Promega | V8751 | |
methanol | Fisher | M/4056/17 | |
MucilAir airway cells | Epithelix | EP01 | |
MucilAir airway cells maintenance media | Epithelix | EP04MM | |
Phenomenex Kinetex 2.6μm, PFP 100A | Phenomenex | 00B-4477-AN | |
TCDD | Sigma Aldrich | 48599 | |
thioTEPA | Sigma Aldrich | T6069 | |
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8µm 2.1 x 50mm | Waters | 86003538 | |
Williams’ E media | Fisher | 17704-024 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
UPLC | Waters | Acquity | |
QTRAP MS | Sciex | ABI Sciex 4000 | |
QTRAP MS software | Sciex | Analyst 1.4.2 | |
luminometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
cell counter | Beckman Coulter | Vi-Cell XR | |
rotary evaporator | Eppendorf | Eppendorf-5301 |