In vitro sistemlerin Metabolik yetkinlik ilaç ve toksik maddelerin biyotransformasyonu ve dışa atılması için önemli bir gereksinimdir. Bu protokol, biz Hücre kültürlerinde metabolizma faz değerlendirmek için referans metabolik sondaları uygulanmasını açıklar.
Ksenobiyotik metabolize eden enzimlerin çözünürlüğü arttırmak ve salgılanmasını kolaylaştırmak fonksiyonel gruplar ilave etmek suretiyle ilaç ve toksik biyotransformasyonu önemli bir işlev görür. Bazı durumlarda, bu yapısal değişiklikler yeni toksik ürünlerin oluşumuna yol açar. hayvanlar üzerinde test azaltmak amacıyla, kimyasal risk metabolik olarak yetkin hücreleri kullanılarak değerlendirilebilir. Metabolik enzimlerin ifadesi, buna rağmen, nitro, birincil kültür sistemlerinde bir çok zaman içinde kararlı değildir ve çoğu zaman hücre çizgilerinde kısmi veya mevcut değildir. Bu nedenle, in vitro ilaç, katkı maddeleri, ve çevre kirliliği yaratanlar metabolizma çalışma ideal metabolik aktivite ile karakterize edilmiştir hücre sistemlerinde yürütülmelidir. Biz UPLC kütle spektrometresi ile ölçülebilir kimyasal probları ve metabolik ürünlerini kullanarak 2B hücre hatları ve primer 3D kültürlerinde metabolik enzimler sınıfının aktivitesini (insan Faz I) ölçmek için, bir yaklaşım açıklar veluminometri. yöntem hücre kuşakları ve çeşitli dokulardan elde edilen birincil hücreler metabolik aktiviteyi test etmek için uygulanabilir.
Ksenobiyotik metabolizma vücuda yabancı kimyasal atılımını 1 kolaylaştırmak için hidrofilik grupların ve bunların konjugatları eklenmesi ile modifiye olan süreçtir. Tipik olarak ksenobiyotiklerin metabolizma bir ya da birden fazla hidroksil grubu 1, 2 ilavesi ile bir oksidasyon çoğunlukla oluşan Faz iki aşamalı bir işlemdir. Örneğin glukuronid veya bir sülfat kısmı 1, 2 gibi bir hidrofobik konjugat için alıcılar olarak Faz II, hidroksil grupları kullanılır. bir alıcı grup zaten molekül üzerinde mevcut ise, konjugasyon adım, bağımsız Faz I metabolizma olabilir. Her bir reaksiyon kimyasal alt tabakalar 3 belirli bir enzimin grubu, örneğin, hidroksilasyon katalize CYP (sitokrom P450), (Şekil 1) ve dealkilasyon ile gerçekleştirilir. ConjugatioN sulfotransferazlar ile katalize edilir, UDP-Glukuronosiltransferazı (Şekil 1), glutation-S-transferaz ve N-asetiltransferaz 4. Her bir doku ve organ bu proteinlerin en ifade karaciğer ile, belirli bir metabolik enzim sentezleme profiline sahip olacaktır.
Şekil 1: Faz I ve kumarin için Faz II Metabolizmasının örneği. CYP2A6 / kumarin 7-hidroksilasyonu katalize CYP2A13. 7-hidroksikumarin UGT1A6 ve UGT1A9 yüksek etkinlik gösteren, faz II enzimleri UGTs bir glukuronid parçasına konjuge olur.
ksenobiotiklerin metabolizmasını anlamak iki nedenden dolayı ilaç güvenliğinin değerlendirilmesinde ve kimyasal risk değerlendirmesi için önemlidir: reaksiyon kinetiği bir uyuşturucu veya kimyasal aktif veya inaktif formu b vücutta ne kadar süre yeni belirleyecekefore boşaltım; ve ana bileşiğin metabolik enzimler tarafından daha reaktif olmayan ve toksik türler için değiştirilebilir. Aynı zamanda "biyoaktivasyon" olarak bilinen bu tür reaksiyonlar çoğunlukla, aynı zamanda, faz II konjugasyon 5 ile nadir durumlarda enzimler CYP faz ile tahrik edilmektedir.
Buna göre, doğru bir ilaç ya da bir kimyasal ile bağlantılı risk tahmin etmek için bir in vitro modelinin özelliği, hücre sistemine bağlı oksijen yetkinlik oldukça bağımlıdır. Hastalıklı dokulardan ya da normal hücrelerin transformasyonu türetilmiş hücre çizgileri genelde bir parçası değilse kökenli 6 bunların dokunun metabolik enzim profili temsil tüm kaybeder. Normal metabolik enzim profili bakımı (en azından kısa süreli kültürlerde), birincil hücre kültürleri daha iyi görünür ve doku onun 3 boyutlu yapısını 1 muhafaza sağlayan bir matris içinde kültürlenir ise daha artırıldı. Bu nedenle, Charbir in vitro hücre sistemine bağlı oksijen yeterliliğin acterization hücre modeli kimyasal güvenlik değerlendirme yapmak için uygun olan ilgili bir karar kılavuz önemli bir ön adımdır.
Bu yazıda bir karaciğer hücre çizgisi 7 ve 3D primer akciğer hücre kültürleri 8 ile uygulama örnekleri ile in vitro aktivite ve Faz I CYP enzimlerinin ekspresyonunu profil bir protokol mevcut. CYP özel alt-tabakalar, bunların metabolik ürünleri ve önleyici kontrol kütle spectrometry- ve lüminojenik tabanlı miktar yöntemler ile birlikte tarif edilmiştir. Bazı CYP uyarılabilir ve diğerleri kurucu olduğu için, örnek aynı zamanda bu iki senaryo için verilecektir.
Şu anda, bir çok standart toksikolojik test sistemleri, normal insan metabolizmasının 1 temsilcisi değildir işlenmiş bakteri, hücre soylarını ya da embriyonik hücreleri kullanır. Bu kimyasal veya tıp potansiyel toksik aktivitesinin yanlış tahminler yol açabilir. Bu tür bir çip üzerinde 3D hücre kültürleri ve organ olarak vitro modellerde, yenilikçi, daha insan dokuları 21, 22, 23, normal morfoloji ve metabolik aktivite çoğaltmak için bir girişimde geliştirilmektedir. Metabolik yetkinlik modelleri iyi toksikolojik değerlendirme ve ilaç biyolojik dönüşüm çalışmaları için uygun olan deşifre kullanılabilen bir kriterdir.
Bu yazıda ana hatlarıyla protokol canlı hücreler kullanılarak CYP enzimlerinin aktivitesini ölçmek için tasarlanmıştır. Esnek ve 2D veya 3D KÜLTÜR farklı hücre sistemleri için kullanılabilires ve lüminojenik Probe veya kütle spektrometresi tabanlı yaklaşım kullanma seçeneğiniz mevcuttur. Her iki yöntem de malzeme nanogram miktarlarda algılar ve sadece çok oyuklu formatta yetiştirilen hücreler az sayıda gerektirecek kadar hassastır. Ayrıca küresel, uygulanabilir veya hücreler karmaşık matrisler içinde büyütülmüştür. prob substratın seçimi tabii ki protokol önemli bir unsurudur. Analizin özgüllüğü seçici CYP inhibitörü kullanılması ile elde edilebilir CYP enzim ve güvence başka bir katman seçici olan prob dayanır. alt-tabakalar ve bu yazıda belirtilen inhibitörleri sadece birkaç örnektir, fakat diğerleri literatürde bulunabilir.
Enzim, düşük bir seviyede ifade edilen bağlı olabilir negatif CYP aktivitesi sonucunda yeni bir hücre tipi ile çalışan birden çok uzun kuluçka süresi dikkate alınması önemlidir. Bir pozitif kontrol olarak kullanılan bir hücre tipinin eklenmesi, söz konusu a sağlamak için tavsiye edilirNegatif sonuç teknik bir sorun ve herhangi sorun gidermeye yardımcı ile bağlantılı değildir. Primer hepatik hücreler metabolik olarak yeterlidir ve süspansiyon içinde örneğin birincil hepatositler için, kontrol olarak kullanılabilir kullanımı çok kolay olan fakat bunların canlılığı zaman içinde sınırlıdır. Karaciğer hücre çizgileri bu protokolde tarif edildiği gibi kullanımı nispeten kolaydır olası alternatifleri vardır, ama bazı metabolik aktivite 6, 21 açısından, diğerlerinden daha iyi olduğu.
Deney toplam protein miktarı olmadıkça, yıkıcı olmayan, olduğu için, uzunlamasına çalışmalarda 20, zaman içinde CYP aktivitesi takip etmek mümkündür. Bazı hücreler kültürde zamanla değişken CYP aktivitesini olacak, çünkü bu önemli bir noktadır. Negatif bir sonuç, in vitro olarak farklılaşma ya da farklılaşmanın giderilmesi ile birleşmeye eksikliği, ilerleme ile ilişkili olabilir. Bu durumda, bu yaklaşım, yarı kantitatif bir olduğuVeriler, her hücre kültürü içinde protein toplam miktarına göre normalize değildir çünkü ettik. TCDD için olduğu gibi doku üzerinde toksik bir etkiye sahip olabilir probları, inhibitörleri, veya teşvik edicilere maruz kalma gibi CYP aktivitesinin ölçülmesi sonra doku yeniden her zaman mümkün değildir ya da önerilmez.
gibi mikrozomlar gibi hücre fraksiyonları, aynı zamanda, belirli bir hücre tipinin, CYP aktivitesinin karakterize edilmesi için kullanılabilir. Mikrozomal preparasyonlar, bununla birlikte, hücre malzemesi, uygun eş-faktörlerin eklenmesi bir çok ihtiyaç ve enzimler aktif kalmasını sağlamak için tampon. canlı hücreleri kullanarak zor mikrozom hazırlık aşamasını ortadan kaldırır ve tamponlar ve ko-faktörler en çok hangi çalışma dışarı.
Genel bir öneri olarak, ayrıca, enzimatik aktivitesini aynı olduğunu doğrulamak için, hücre kültürlerinde CYP'ler ekspresyon profilini karakterize etmek için en iyi yöntemdir. doğrulama Bu ek seviye metabolik sondalar Enti olmadığını verilmiş tavsiye edilirTek bir CYP özgü bel ve ölçülen metabolik aktivitesi, ilgili enzim ekspresyonu ile eşleştirilir artan bir güven vermektedir. CYP zar proteinlerini olduğu bu nedenle nicel RT-PCR, bu enzimleri 20 profil tercih edilen bir yaklaşım olmuştur, Western blotlar için hazırlamak için nispeten zordur.
Protokol, tek önemli bir şekilde de olsa, metabolik enzimlerin bir ailesini temsil eder deney CYP enzim aktivitesi için bir yöntem açıklanır dikkat etmek önemlidir. Bir kütle spektrometresi yaklaşımın esnekliği prob substratlar diğer metabolik dönüşümler için satın alma yöntemlerinin geliştirilmesini sağlar. Bununla birlikte, bu bir anda geliştirilecek ve şu anda bilinen daha az spesifik problar ve diğer metabolik enzim ailesi için seçici inhibitörler vardır. Bu boşluk, in vitro hücre sistemlerin t metabolik yeterlilik kapsamlı bir değerlendirme sağlamak için ele alınmalıdırMS.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.
Reagent & Cells | |||
2 μm syringe filter | Whatman | UN203NPEORG | |
24 well plate | Corning | 3524 | |
4-methylumbelliferone | Sigma Aldrich | M1381 | |
5-phenyl pentyne | Sigma Aldrich | CD5001437 | |
6-hydroxybupropion | Sigma Aldrich | H3167 | |
6-hydroxychlorzoxazone | Sigma Aldrich | UC148 | |
7-ethoxycoumarin | Sigma Aldrich | 195642 | |
7-hydroxycoumarin | Sigma Aldrich | H24003 | |
8-methoxypsoralen | Sigma Aldrich | M3501 | |
acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
acetonitrile | Fisher | A/0626/17 | |
α-naphthoflavone | Sigma Aldrich | N5757 | |
BCA kit | Thermo Scientific | 23227 | |
b-glucuronidase/arylsulfatase | Sigma Aldrich | G0876 | |
Bupropion | Sigma Aldrich | B102 | |
Carbamazepine | Sigma Aldrich | C4024 | |
chlorzoxasone | Sigma Aldrich | C4397 | |
collagen | Cell Systems | 5005-B | |
coumarin | Sigma Aldrich | C4261 | |
disulfiram | Sigma Aldrich | 86720 | |
fluvoxamine | Sigma Aldrich | F2802 | |
Glutamax (Glutamine supplement) | Fisher | 35050061 | |
HepaRG metabolism supplement | Merck | MMAD621 | |
HepaRG thaw media supplement | Merck | MMADD671 | |
HepaRG | Merck | MMHPR116 | |
Luciferin-CEE | Promega | V8751 | |
methanol | Fisher | M/4056/17 | |
MucilAir airway cells | Epithelix | EP01 | |
MucilAir airway cells maintenance media | Epithelix | EP04MM | |
Phenomenex Kinetex 2.6μm, PFP 100A | Phenomenex | 00B-4477-AN | |
TCDD | Sigma Aldrich | 48599 | |
thioTEPA | Sigma Aldrich | T6069 | |
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8µm 2.1 x 50mm | Waters | 86003538 | |
Williams’ E media | Fisher | 17704-024 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
UPLC | Waters | Acquity | |
QTRAP MS | Sciex | ABI Sciex 4000 | |
QTRAP MS software | Sciex | Analyst 1.4.2 | |
luminometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
cell counter | Beckman Coulter | Vi-Cell XR | |
rotary evaporator | Eppendorf | Eppendorf-5301 |