Detecção da expressão de microRNA na Membrana Peritoneal de Ratos Usando PCR Quantitativa em Tempo Real

Summary

Aqui apresentamos um protocolo para a detecção da expressão de microRNA na membrana peritoneal de ratos utilizando uma reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa em tempo real quantitativa. Este método é adequado para estudar o perfil de expressão de microARN na membrana peritoneal de ratos em várias condições patológicas.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) são pequenos ARNs não codificados que regulam a expressão de ARN mensageiro pós-transcrição. O perfil de expressão de miARN foi investigado em vários órgãos e tecidos em ratos. No entanto, os métodos padrão para a purificação de miRNAs e a detecção de sua expressão na membrana peritoneal de ratos não foram bem estabelecidos. Desenvolvemos um método eficaz e confiável para purificar e quantificar miARNs usando reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa em tempo real quantitativa (qRT-PCR) em membrana peritoneal de rato. Este protocolo consiste em quatro etapas: 1) purificação da amostra de membrana peritoneal; 2) purificação do ARN total, incluindo o miARN da amostra de membrana peritoneal; 3) transcrição reversa de miARN para produzir cDNA; E 4) qRT-PCR para detectar a expressão de miARN. Usando este protocolo, determinamos com sucesso que a expressão de seis miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 e miRNA-34a-5p) aumentaramSignificativamente na membrana peritoneal de um modelo de fibrose peritoneal do rato em comparação com aqueles em grupos controle. Este protocolo pode ser usado para estudar o perfil da expressão de miARN na membrana peritoneal de ratos em muitas condições patológicas.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) são curtos, não codificando RNAs que post-transcriptionally regulam o mensageiro RNA (mRNA) expressão ¹ . Alterações na expressão de miARNs regulam a expressão de muitos mRNAs que desempenham papéis fundamentais em várias condições patológicas, incluindo câncer, inflamação, distúrbios metabólicos e fibrose ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} . Portanto, os miARN têm potencial como novos biomarcadores e alvos terapêuticos ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} . O perfil de expressão de miARN foi determinado em vários ratosÓrgãos e tecidos, incluindo fígado, coração, pulmão e rim ⁹ . No entanto, os métodos padrão para a purificação e detecção de miRNAs na membrana peritoneal de ratos não foram bem estabelecidos.

O objetivo geral deste protocolo é purificar com sucesso e detectar miARN na membrana peritoneal do rato. Primeiro, a amostra de membrana peritoneal foi homogeneizada usando um homogeneizador de vidro, seguido de exposição a um sistema de trituração de biopolímero em uma coluna de centrifugação de microcentrífuga ¹⁰ . Em seguida, o ARN total incluindo o miARN foi purificado a partir da amostra de membrana peritoneal usando uma coluna de rotação à base de sílica ¹⁰ . Em seguida, o cDNA foi sintetizado a partir do ARN total purificado utilizando transcriptase reversa, poli (A) polimerase e oligo-dT iniciador ¹¹ . Finalmente, a expressão de miARN foi determinada por qRT-PCR usando um corante intercalador ¹¹ . A lógica deste protocolo é bEm estudos anteriores que mostraram uma purificação e detecção significativa de miARN em tecidos por um processo simples ^{8 , 10 , 11} . Foi relatado que o uso de um sistema de trituração de biopolímero em uma coluna de rotação de microcentrífuga e coluna de rotação baseada em membrana de sílica pode purificar ARN total de alta qualidade a partir dos tecidos ¹⁰ . O método de síntese de cDNA a partir de ARN total purificado utilizando transcriptase reversa, poli (A) polimerase e iniciador oligo-dT, e o método de detecção de expressão de miARN por qRT-PCR utilizando corante intercalante neste protocolo foram relatados para mostrar alta precisão e Sensibilidade ¹¹ . Além disso, este é um processo simples, que economiza tempo e evita erros técnicos. Portanto, este protocolo é útil em estudos que requerem detecção altamente precisa e sensível de miARN em membrana peritoneal de ratos em uma ampla gama de condições patológicas.

Protocol

Todos os protocolos experimentais de animais foram aprovados pelo comitê de ética animal da Universidade Médica de Jichi e foram realizados de acordo com as diretrizes de Uso e Cuidados de Animais Experimentais do Guia da Universidade Médica de Jichi para animais de laboratório. 1. Coleção de amostra de peritônio Colecione os seguintes itens: tubo de centrífuga de 50 ml com algodão encharcado em isoflurano, folha de cortiça, placa de Petri com solução salina tamponada…

Representative Results

Os resultados apresentados aqui são baseados em nosso estudo relatado anteriormente 8 . Nós investigamos o perfil de expressão de miARN na fibrose peritoneal. A fibrose peritoneal é uma importante complicação na diálise peritoneal. É caracterizada pela perda da monocamada de células mesoteliais e pelo excesso de acumulação de componentes da matriz extracelular e está associada à insuficiência da membrana peritoneal 14 ,</…

Discussion

Usando o protocolo apresentado neste manuscrito, miRNAs na membrana peritoneal de ratos foram purificados com sucesso e detectados usando qRT-PCR. A confiabilidade da análise de dados de qRT-PCR depende da qualidade dos miARN purificados. Portanto, a pureza dos miRNAs pode ser verificada antes da qRT-PCR pela proporção de absorvência a 260 nm para a de 280 nm, que pode ser medida usando um espectrofotômetro. Quando a amplificação significativa do miARN não pode ser obtida usando qRT-PCR, a concentração de ADNc…

Materials

QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	silica-membrane based spin column
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	phenol/guanidine-based lysis reagent
Buffer RLT	Qiagen	79216	wash buffer 1
Buffer RWT	Qiagen	1067933	wash buffer 2
miScript II RT kit	Qiagen	218161	includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	not disclosed
miRNA-142-3p primer	Qiagen	MS00031451	5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3'
miRNA-21-5p primer	Qiagen	MS00009079	5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3'
miRNA-221-3p primer	Qiagen	MS00003857	5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3'
miRNA-223-3p primer	Qiagen	MS00033320	5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3'
miRNA-34a-5p primer	Qiagen	MS00003318	5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3'
miRNA-327 primer	Qiagen	MS00000805	5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3'
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
methylglyoxal	Sigma-Aldrich	M0252
Midperic	Terumo	not assign	peritoneal dialysis fluid
Sprague–Dawley rats	SLC	not assign