Aqui apresentamos um protocolo para a detecção da expressão de microRNA na membrana peritoneal de ratos utilizando uma reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa em tempo real quantitativa. Este método é adequado para estudar o perfil de expressão de microARN na membrana peritoneal de ratos em várias condições patológicas.
MicroRNAs (miRNAs) são pequenos ARNs não codificados que regulam a expressão de ARN mensageiro pós-transcrição. O perfil de expressão de miARN foi investigado em vários órgãos e tecidos em ratos. No entanto, os métodos padrão para a purificação de miRNAs e a detecção de sua expressão na membrana peritoneal de ratos não foram bem estabelecidos. Desenvolvemos um método eficaz e confiável para purificar e quantificar miARNs usando reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa em tempo real quantitativa (qRT-PCR) em membrana peritoneal de rato. Este protocolo consiste em quatro etapas: 1) purificação da amostra de membrana peritoneal; 2) purificação do ARN total, incluindo o miARN da amostra de membrana peritoneal; 3) transcrição reversa de miARN para produzir cDNA; E 4) qRT-PCR para detectar a expressão de miARN. Usando este protocolo, determinamos com sucesso que a expressão de seis miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 e miRNA-34a-5p) aumentaramSignificativamente na membrana peritoneal de um modelo de fibrose peritoneal do rato em comparação com aqueles em grupos controle. Este protocolo pode ser usado para estudar o perfil da expressão de miARN na membrana peritoneal de ratos em muitas condições patológicas.
MicroRNAs (miRNAs) são curtos, não codificando RNAs que post-transcriptionally regulam o mensageiro RNA (mRNA) expressão 1 . Alterações na expressão de miARNs regulam a expressão de muitos mRNAs que desempenham papéis fundamentais em várias condições patológicas, incluindo câncer, inflamação, distúrbios metabólicos e fibrose 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Portanto, os miARN têm potencial como novos biomarcadores e alvos terapêuticos 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . O perfil de expressão de miARN foi determinado em vários ratosÓrgãos e tecidos, incluindo fígado, coração, pulmão e rim 9 . No entanto, os métodos padrão para a purificação e detecção de miRNAs na membrana peritoneal de ratos não foram bem estabelecidos.
O objetivo geral deste protocolo é purificar com sucesso e detectar miARN na membrana peritoneal do rato. Primeiro, a amostra de membrana peritoneal foi homogeneizada usando um homogeneizador de vidro, seguido de exposição a um sistema de trituração de biopolímero em uma coluna de centrifugação de microcentrífuga 10 . Em seguida, o ARN total incluindo o miARN foi purificado a partir da amostra de membrana peritoneal usando uma coluna de rotação à base de sílica 10 . Em seguida, o cDNA foi sintetizado a partir do ARN total purificado utilizando transcriptase reversa, poli (A) polimerase e oligo-dT iniciador 11 . Finalmente, a expressão de miARN foi determinada por qRT-PCR usando um corante intercalador 11 . A lógica deste protocolo é bEm estudos anteriores que mostraram uma purificação e detecção significativa de miARN em tecidos por um processo simples 8 , 10 , 11 . Foi relatado que o uso de um sistema de trituração de biopolímero em uma coluna de rotação de microcentrífuga e coluna de rotação baseada em membrana de sílica pode purificar ARN total de alta qualidade a partir dos tecidos 10 . O método de síntese de cDNA a partir de ARN total purificado utilizando transcriptase reversa, poli (A) polimerase e iniciador oligo-dT, e o método de detecção de expressão de miARN por qRT-PCR utilizando corante intercalante neste protocolo foram relatados para mostrar alta precisão e Sensibilidade 11 . Além disso, este é um processo simples, que economiza tempo e evita erros técnicos. Portanto, este protocolo é útil em estudos que requerem detecção altamente precisa e sensível de miARN em membrana peritoneal de ratos em uma ampla gama de condições patológicas.
Usando o protocolo apresentado neste manuscrito, miRNAs na membrana peritoneal de ratos foram purificados com sucesso e detectados usando qRT-PCR. A confiabilidade da análise de dados de qRT-PCR depende da qualidade dos miARN purificados. Portanto, a pureza dos miRNAs pode ser verificada antes da qRT-PCR pela proporção de absorvência a 260 nm para a de 280 nm, que pode ser medida usando um espectrofotômetro. Quando a amplificação significativa do miARN não pode ser obtida usando qRT-PCR, a concentração de ADNc…
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a Miyako Shigeta por seu excelente suporte técnico. Este trabalho foi parcialmente apoiado por JSPS KAKENHI (número de concessão 25461252).
QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |