zebravis<em> In Situ</em> Spinal Cord Voorbereiding voor elektrofysiologische registraties van Spinal sensorische en motorische neuronen

Summary

Dit manuscript beschrijft werkwijzen voor elektrofysiologische opnames van spinale neuronen van zebravis embryo's en larven. Het preparaat handhaaft neuronen in situ en vaak gaat om minimale dissectie. Deze werkwijzen maken het elektrofysiologisch onderzoek van verschillende spinale neuronen van de initiële elektrische prikkelbaarheid overname door de vroege larvale stadia.

Abstract

Zebravis, voor het eerst geïntroduceerd als een ontwikkelingsmodel, hebben opgedaan populariteit in vele andere gebieden. Het gemak van het houden van grote aantallen snel ontwikkelende organismen, gecombineerd met de embryonale optische helderheid, diende als de eerste overtuigende kenmerken van dit model. In de afgelopen twee decennia is het succes van dit model verder voortgestuwd door zijn ontvankelijkheid voor grootschalige mutagenese schermen en door het gemak van transgenese. Meer recent zijn gen-editing benaderingen van de kracht van het model uitgebreid.

Voor neurologische studies, de zebravis embryo en larven kunnen dus model waaraan meerdere methoden kunnen worden toegepast. Hier richten we ons op methoden die de studie van een essentiële eigenschap van neuronen, elektrische prikkelbaarheid mogelijk te maken. De voorbereiding van de elektrofysiologische studie van zebravis spinale neuronen omvat het gebruik van lijm dierenarts hechting aan het preparaat een opnamekamer garanderen. Alternatieve methoden voor het opnemenvan zebravis embryo's en larven omvatten de hechting van het preparaat aan de kamer met een fijne wolfraamstift ^{1, 2, 3, 4, 5.} Een wolfraamstift wordt meestal gebruikt om het preparaat in een zijdelingse richting zet, al is gebruikt om larven dorsale zijde omhoog ⁴ monteren. De hechting lijm is gebruikt om embryo's en larven in beide richtingen te monteren. Gebruik van de lijm kan een minimale dissectie worden uitgevoerd, waardoor de toegang tot spinale neuronen zonder toepassing van een enzymatische behandeling, waardoor schade geen vermijden. Voor larven, is het noodzakelijk een korte enzymbehandeling toepassing op het spierweefsel rond het ruggenmerg verwijderd. De hier beschreven methoden zijn toegepast om de intrinsieke elektrische eigenschappen van motorneuronen, interneuronen en sensorische neuronen op verschillende developmentà bestuderenl trappen ^{6, 7, 8, 9.}

Introduction

George Streisinger pionier in het gebruik van Danio rerio, beter bekend als de zebravis als een modelsysteem voor de genetische analyse van gewervelde ontwikkeling ^10. Het model biedt verscheidene voordelen waaronder: (1) betrekkelijk eenvoudige en goedkope veeteelt; (2) externe bevruchting, waardoor u gemakkelijk toegang tot de embryo's uit de vroegste ontwikkelingsfasen; en (3) een transparante embryo, die rechtstreeks en herhaalde waarnemingen van cellen, weefsels en organen zij vormen.

In de daaropvolgende decennia verschillende ontwikkelingen verder vergroot de kracht van de zebravis model. In het bijzonder naar voren genetische screens en hele genoom sequencing inspanningen speelden een belangrijke rol in de identificatie van mutaties en genen van cruciaal belang voor vele ontwikkelingsprocessen ^{11, 12, 13, 14,}"> ^{15 16.} Gateway klonering werkwijzen kon de routinematige toepassing van transgene benaderingen ^{17, 18.} Recente vooruitgang in genoom uitgeven, met als voorbeeld transcriptie-activator-achtige (Talens) en geclusterde regelmatige afstand van elkaar korte palindroom herhalingen (CRISPR) -Cas9 nucleasen, zorgen voor de beoogde invoering van mutaties, evenals knock-out en knock-in benadert ^{19, 20, 21, 22.} Gecombineerd, deze methoden maken zebravis een krachtig model voor de studie van de genetische mechanismen die ten grondslag liggen aan specifieke gedragingen en verschillende ziekten bij de mens ^{23, 24, 25, 26, 27.}

Dit werk richt zich op de ontwikkeling vanmentale regelgeving en de rol van de elektrische activiteit in neuronale ontwikkeling. De nadruk ligt op het ruggenmerg, waarbij de zebravismodel verschaft verscheidene voordelen. Ten eerste is het relatief eenvoudig om toegang te krijgen tot de zebravis op de embryonale en larvale stadia; Daarom kan men ruggenmerg functie te bestuderen tijdens ontwikkelingsstadia die minder neuronen en eenvoudigere circuits ^{28, 29} hebben. Bovendien is de zebravis ruggenmerg heeft een diverse set van neuronen, vergelijkbaar met andere gewervelde dieren, zoals gedemonstreerd door karakteristieke en kenmerkende patronen van transcriptiefactoren ^{30, 31, 32, 33, 34, 35.}

De meeste studies in zebravis die gericht zijn op de mechanismen die de functie van het ruggenmerg ten grondslag liggen bloot circuits, met nameDegenen die voortbeweging ondersteunen, zijn begrijpelijkerwijs gericht op larvale stadia ^{36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43.} Veel van de neuronen die het ruggenmerg loc netwerken vormen initiëren hun differentiatie in vroege embryonale stadia ~ 9-10 uur na bevruchting (HPF) ^{44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51.} Met het oog hierop, begrijpen hoe de morfologische en elektrische eigenschappen van spinale neuronen ontstaan ​​en verandering tussen de embryonale en larvale stadia is belangrijk voor een overall kennis van de vorming en functie bewegingsapparaat circuit.

De dissectie hier beschreven methoden mogelijk patch clamp opnamen van spinale neuronen en met succes toegepast op embryonale stadia (~ 17-48 HPF) en larvale stadia (~ 3-7 dagen na de bevruchting [DPF]). Deze aanpak beperkt de hoeveelheid dissectie die nodig is om de toegang tot de neuronen van belang. Het protocol verschilt van de meeste andere gepubliceerde methoden voor het registreren van zebravis spinale neuronen doordat dierenarts hechting lijm wordt toegepast, in plaats van een fijne wolfraamstift, het embryo of larven hechten aan de registratiekamer. De beschikbaarheid van twee verschillende benaderingen (dwz hechtdraad lijm ten opzichte van de wolfraam pin) voor het monteren van de zebravis embryo's of larven voor elektrofysiologische analyse geeft onderzoekers met alternatieve mogelijkheden om hun specifieke experimentele doelen te bereiken.

Ten eerste, de procedures voor het openen en het opnemen van een pop ulatie primaire sensorische neuronen, Rohon Beard-cellen beschreven. De cellichamen van deze neuronen liggen in de dorsale ruggenmerg. Rohon-Beard cellen bestaan in diverse gewervelde species, differentiëren vroeg in de ontwikkeling en ten grondslag aan de embryonale aanslagreactie ^{6, 44, 47, 48.}

Ten tweede, procedures voor het openen en het opnemen van spinale motorische neuronen gedetailleerd. Zebravis spinale motorische neuronen voordoen bij twee golven van neurogenese. De eerder geboren primaire motorische neuronen ontstaan eind van gastrulatie (~ 9-16 HPF), met slechts 3-4 primaire motorische neuronen onderhavige per hemisegment ^{45, 46, 49.} Daarentegen De latere populatie van secundaire motorische neuronen talrijker en ontstaat gedurende langere tijd, te beginnen bij ~ 14 HPFef "> 45 ^50. secundaire motor neuron genesis midden bundelsegmenten wordt meestal afgesloten met 51 HPF ^50. Secundaire motorneuronen worden beschouwd als de tegenhanger van motorneuronen in amnioten zijn ^46. Interessant supraspinale neuronen, via dopamine reguleren motoriek in de larve en secundaire motor neuron ontstaan in het embryo en jonge larven ^{50, 51.} Primaire en secundaire motorische neuronen bevatten elk verschillende subtypes. elke primaire motorische neuron subtype projecteert een perifere axon dat een kenmerk spiergroep innerveert, leidt tot een stereotype, identificeren axonale traject. In het algemeen, secundaire motorneuronen volgen axonale trajecten eerder bij primaire motorische neuronen. Aldus opzichte van axonale trajecten, primaire en secundaire motorische neuronen vergelijkbaar, behalve dat axonale dikte en grootte een somatare groter voor primaire motorische neuronen ^45.

Ten derde, werkwijzen voor het opnemen van enkele soorten interneuronen besproken. In deze gevallen beperkt verwijdering van andere ruggenmerg cellen is vereist, om zo het ruggenmerg meer intact dan bij opnamen van Rohon-Beard cellen of motorneuronen.

Protocol

Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC; Office of Laboratory Animal Resources, Universiteit van Colorado Anschutz Medical Campus). 1. zebravis Veehouderij Verhogen en volwassen zebravis (Danio rerio) te handhaven op 28,5 ° C op een 10 uur donker / 14 uur lichtcyclus en met de juiste waterbehandeling en uitwisseling 52. Verhogen zebravis embryo / larven bij 28,5 ° C in embr…

Representative Results

We hebben met succes opgenomen van Rohon-Beard neuronen in 17 HPF embryo tot 7 DPF larven (figuur 5A en 5B). Wanneer Rohon-Beard cellen werden opgenomen, werd de bereiding gemonteerd dorsale kant naar boven. Dergelijke bevestiging maakt de ondubbelzinnige identificatie van Rohon-Beard cellen op basis van hun oppervlakkige dorsale positie en grote soma maten. De identificatie wordt bovendien bevestigd door de stereotiepe gehyperpolariseerde rust membraanp…

Discussion

De hier beschreven werkwijzen maken de elektrische en morfologische karakterisering van sensorische en motorische neuronen van zebravis embryo's na een minimale dissectie van het ruggenmerg. Neuronen gezond blijven gedurende ten minste 1 uur, de tijdslimiet opgelegd aan deze opnames. Neuronen werden opgenomen met de standaard whole-cell configuratie, alsmede uit kernhoudende pleisters; deze methode kunnen space-clamp problemen die een gedetailleerde studie van biofysische ionenstromen ⁹ kunne…

Materials

Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore	Corning	431096
Syringe filter 0.2 mm	Whatman	6780-2502
Tricaine	Sigma	A-5040	Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt
a-bugarotoxin	Tocris	11032-79-4
Tetrodotoxin	Tocris	4368-28-9
Alexa-549 hydrazine salt	Molecular Probes	A-10438	fluorescent dye
Spin-X centrifuge tube filter	Corning	8161
Glass microscope slide	Fisher	12-550C
Sylgard silicone elastomer kit	Dow Corning	184	silicone elastomer
Petri dishes	Falcon	351029
Borosilicate glass capillaries	Harvard Apparatus	30-0038	inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries)
Borosilicate glass capillaries	Drummond Scientific	1-000-1000-100	inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries)
Miniature barbed polypropylene fitting	Cole-Palmer	6365-90
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Collagenase XI	Sigma	C7657
Microelectrode puller	Sutter Instruments	Model P-97
Amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200B
Head stage	Molecular Devices	CV203BU
Motorized micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Tygon tubing	Fisher	14-169-1B	ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing)
Electrode holder	Molecular Devices	1-HC-U
Pharmaseal Three-Way Stopcocks	Baxter	K75
Digitizer	Axon Instruments	Digidata 1440A
Inverted microscope	Zeiss	Axioskop2 FS plus
40x/0.80w Achroplan objective	Zeiss
Data acquisition and analysis software	Axon Instruments	PClamp 10 – Clampex and Clampfit
Micropipette puller	Sutter Instruments	Model P-97
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection and Recording Solutions(in mM)
All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 – 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT).
The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20°C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use.
Dissection/Ringer’s solution			145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH)
Pipette (intracellular) recording solution			135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH).
Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp			125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH).
Alexa-594 hydrazine salt stock solution.			Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 µl) and store at -20°C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution  with a centrifuge tube filter.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immobilizing agents
0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)			Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris
		Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20°C.
		For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media
250 μM α-bungarotoxin		Prepare a 250 μM stock in ddH2O (1 mg/500 μl), prepare 100 µl aliquots, and sotre at -20°C.
		For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM.
1 mM Tetrodotoxin		Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 µl aliquots, and sotre at -20°C.
		For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM.