Her præsenterer vi en protokol til at fremkalde tolerance i transplantation, og vurdere in vitro og i vivo særskilt celle subsets fra modtageren smittespredningshæmmende kapacitet og immunstatus modtagerens mod donor eller eksogen antigener.
Den største bekymring i transplantation er at opnå specifikke tolerance gennem induktion af regulerende celler. Forståelse af tolerance mekanismer kræver pålidelig modeller. Her beskriver vi modeller af tolerance over for kardiale allograft i rotte, induceret af blokade af costimulation signaler eller Opregulering af immunregulerende molekyler gennem genoverførsel. Hver af disse modeller tilladt i vivo generation af lovgivningsmæssige celler som regulerende T-celler (Tregs), regulerende B celler (Bregs) eller regulerende myeloide celler (RegMCs). I dette manuskript beskriver vi to supplerende protokoller, der er blevet brugt til at identificere og definere i in vitro og i vivo regulerende celleaktivitet for at bestemme deres ansvar i tolerance induktion og vedligeholdelse. Først, en in vitro- undertrykkende assay tilladt hurtig identifikation af celler med undertrykkende kapacitet på effektor immunrespons i en dosis afhængige måde, og kan bruges til yderligere analyse som cytokin måling eller cytotoksicitet. Andet, adoptiv overførsel af celler fra et tolerant behandlede modtageren til en nyligt bestrålede podede modtager, fremhæves tolerogenic egenskaberne af disse celler styre graft instrueret immunrespons og/eller konvertering af nye regulerende celler ( betegnes smitsomme tolerance). Disse metoder er ikke begrænset til celler med kendt fænotypiske markører og kan udvides til at omfatte enhver celle befolkning. Derudover instrueret donor allospecificity af regulerende celler (et vigtigt mål i feltet) kan vurderes ved hjælp af tredjeparts donor celler eller pode enten in vitro eller i vivo. Endelig, for at finde ud af disse regulerende celler specifikke tolerogenic kapacitet, vi leverer protokoller for at vurdere de humorale anti-donor antistof svar og modtagerens evne til at udvikle humorale svar mod nye eller tidligere kendte antigener. Modeller af tolerance beskrevet kan bruges til at karakterisere yderligere lovgivningsmæssige celler, for at identificere nye biomarkører og immunregulerende molekyler, og kan tilpasses til andre transplantation modeller eller autoimmune sygdomme i gnaver eller menneskelige.
Hjerte allograft i rotte er en pålidelig orgel transplantation model til at vurdere tolerancen induktion behandlinger, for at dechifrere mekanismerne af tolerance induktion og vedligeholdelse, og har potentiale til at fremkalde funktionelt kompetente og dominerende regulerende celler. Protokollerne nedenfor beskriver en fuldt uoverensstemmelse heterotopisk hjerte graft fra Lewis 1W donor rotte (LEW.1W, RT1u) i en Lewis 1A modtager rotte (LEW.1A, RT1en). I denne graft kombination, akut afvisning opstår hurtigt (i ca. 7 dage) og nemt kan vurderes ved graft slå måling gennem palpering af maven. Her foreslår vi tre tilknyttede protokoller for at fremkalde tolerance over for den kardiale allograft i rotte. I disse modeller, tolerance er induceret og/eller vedligeholdes af forskellige lovgivningsmæssige celletyper. Første, blokering af CD40-CD40L interaktioner med en adenovirus kodning CD40Ig (AdCD40Ig) fremkaldt generation af CD8+ Tregs i stand til at inducere tolerance når adoptively overført til sekundære podede modtagere1. Desuden nedbrydning af CD8+ celler (med anti-CD8α antistoffer) i AdCD40Ig-behandlet modtagere genereret Bregs og RegMCs2. Dyb analyse af CD8+ Tregs egenskaber fremhævet den afgørende rolle af flere immunregulerende molekyler defineret som interleukin-34 (IL-34) og Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Overekspression af IL-34 (med en AAV vektor) fremkaldte Tregs gennem generation af RegMCs, induceret overekspression af FGL-2 Bregs, underliggende lovgivningsmæssige celler komplekse netværk.
Fordi kronisk afvisning udvikler sig langsomt og er langsigtede, er en dybtgående analyse påkrævet at skelne tolerance versus kronisk afvisning. Transplantat vurderes normalt for celle infiltration, fibrose, fortykkelse af vaskulære væg og supplement C4d aflejring af immunohistology7. Mens histologi metoder kræver animalske offer eller pode biopsi, her beskriver vi en enkel metode til at vurdere forskellige funktioner af tolereret allograft: fremkomsten og funktion af regulerende celler og anti-donor specifikt antistof svar fra blod prøve ved flowcytometri (her, vi brugte fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS)).
Vedligeholdelse af tolerance over for allograft efter anholdelsen af behandlingen er generelt forbundet med induktion af regulerende celler8. I de sidste årtier, undersøgelser fokuseret på CD4+Tregs enstemmigt karakteriseret dem af de vigtigste markører Foxp3+, CD25højog CD127–9,10,11. Ligeledes flere markører blev tilskrevet CD8+ Tregs, som CD122+, CD28–, CD45RClav, PD1+, og Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. over år, udtryk for GITR, CTLA4 og cytokiner (IL-10, TGFβ, IL-34, IL-35, FGL-2) var desuden tilknyttet en langsomme profil3,4,6,13, 18,19,20,21. Imidlertid nye lovgivningsmæssige cellepopulationer, såsom Bregs, RegMCs eller NKTregs, mangle relevante specifikke markører. Ja, Bregs er for det meste rapporteret som umodne CD24+ celler, med tvetydige CD27 udtryk og undertiden produktionen af IL-10, TGFβ eller granzyme B22,23,24. Kompleksiteten af myeloide celler slægt kræver en kombination af flere markører til at definere deres lovgivningsmæssige eller proinflammatoriske profil såsom CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a eller CD16325,26. Endelig nogle markører er blevet rapporteret til at identificere NKTregs såsom CD11b+, CD27+, TGFβ+, men yderligere undersøgelser er nødvendige for at yderligere fænotype beskrive dem27,28,29 ,30,31,32. Således beviser af undertrykkende aktivitet er nødvendige for at legitimere yderligere fænotypiske beskrivelse til at identificere nye biomarkører, nye immunregulerende mæglere, og til at udvide anvendelsesområdet til nye celle behandlingsformer.
Vi foreslår to komplementære metoder til at evaluere den smittespredningshæmmende aktivitet af celler. Først, in vitro- metode består af dyrkning smittespredningshæmmende celler med mærket effektor T celler stimuleret af allogene donorer antigen præsentere celler (PMV’er) på forskellige nøgletal over 6 dage, og analysere effektor T celler spredning, afspejler donor-instrueret immunsuppression. Celler fra behandlede rotter kan sammenlignes direkte med celler fra naiv rotter og ubehandlede podede rotter for undertrykkende aktivitet (eller nogen andre regulerende celle befolkning), i en række suppressor: effektor nøgletal. Desuden, denne metode kræver ikke nogen transplantation, og resultaterne foreligger inden 6 dage. Andet, i vivo metode består af overføre de påtænkte regulerende celler fra et behandlet rotte til en nyligt bestrålede podede modtager. Mens B celler, myeloide celler eller T celler fra ubehandlede naive rotter er som regel ude af stand til at hæmme akut afvisning og forlænge graft overlevelse ved adoptiv overførsel, celler med forstærket smittespredningshæmmende aktivitet fra behandlet-modtagere har disse attributter 1,2,3,4,33. Lymfopeni induceres ved bestråling af modtageren anbefales at tillade adoptively overførte celler til at forblive upåvirket af blod homøostase og at mestre mere let anti-donor immunrespons. For begge metoder, in vitro- udnyttelse af allogene tredjemand PMV’er eller i vivo adoptiv overførsel af undertrykkende Tillad celler til modtagere podet med en tredjeparts-hjerte analyse af anti-donor specificitet. Der henviser til, at metoden i vivo kræver et betydeligt antal celler, dårligt repræsenteret kan celle delpopulationer vurderes mere let for undertrykkende aktivitet in vitro-33.
Humorale svar kan også måles for at vurdere tilstand af tolerance og kontrol af styret antistof svar til donor antigener. Faktisk, tolerance kan være kendetegnet ved fravær af humorale respons mod donor men bevarelse af kapacitet for modtagere at udvikle humorale respons til nye antigener og bevarelse af hukommelse svar. Først, er princippet om alloantibody påvisning baseret på anerkendelse af donor celler af modtagerens antistoffer efter inkubation af donor celletype med serum fra en podede modtageren. Andet, humorale svar rettet mod eksogene antigener kan være vurderet følgende stimulering af langsigtede tolerant modtagere med Nøglehullet Limpet Hemocyanin (KLH) emulgeret med komplet Freund’s adjuvans. Tilstedeværelsen af specifikke IgM og IgG antistoffer mod antigener kan registreret 4 og 13 dage, henholdsvis efter vaccination, med enzym forbundet ImmunoSorbent Assay (ELISA)34. For det tredje, bevarelse af immun hukommelse svar kan vurderes ved injektion af xenogene røde blodlegemer (RBC) på dage -7 og + 3 af transplantation og røde blodlegemer farvning med recipient serum indsamlet på dage + 8 og + 17 efter transplantation. Alle disse metoder giver mulighed for identifikation af immunoglobulin undertyper ved hjælp af specifikke sekundære antistoffer, og hurtig overtagelse af resultater i mindre end 1,5 h ved FACS farvning eller et par timer ved ELISA.
Endelig disse protokoller er designet til karakterisering af transplantation modeller, og kan være, til dels, anvendt til autoimmune sygdomsmodeller. Principperne i metoden, der kan overføres til alle arter.
Adoptiv overførsel af samlede splenocytes i en nyligt podede modtager er en effektiv måde at påvise tilstedeværelsen af reguleringsmæssige celler inducerede eller forstærkede ved en behandling. Værten bestråling-induceret forbigående lymfopeni fremmer celle overlevelse efter overførsel og etablering af tolerance. Derudover giver subletale bestråling tid til celler med tolerogenic egenskaber til at konvertere til nye lovgivningsmæssige celler under immune rekonstitution, et fænomen kaldet smitsomme tolerance<…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev realiseret i forbindelse med projektets Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01), som er en del af programmet “Investissements d’Avenir” franske regering forvaltes af ANR (ANR-11-LABX-0016-01) og af IHU-Cesti projektet finansieres også af den ” Investissements d’Avenir”franske regering program, forvaltet af den franske nationale forskning agentur (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Projektets IHU-Cesti understøttes også af Nantes Métropole og Région Pays de la Loire.
animals | |||
LEW.1W and LEW.1A rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
BN third party donor rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
nom | company | catalogue number | comments |
reagents | |||
AdCD40Ig | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
IL34-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
FGL2-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
anti-TCR | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | R7/3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD25 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX39 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD8 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX8 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD45RA | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX33 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD161 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | 3.2.3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD11b/c | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX42 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-TCRgd | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | V65 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD45RC | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX22 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD4 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX35 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD45R | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554881, His24 clone | |
anti-rat IgG-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #112-096-071 | |
anti-rat IgG1 | Serotec | #MCA 194 | |
anti-rat IgG2a | Serotec | #MCA 278 | |
anti-rat IgG2b | Serotec | #MCA 195 | |
anti-rat IgM-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #115-095-164 | |
streptavidin HRP | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554066 | |
KLH | Sigma Aldrich, St. Louis, USA | #9013-72-3 | |
PBS 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, | |
Tween 20 | Sigma, Saint-Louis, USA | #9005-64-5 | |
TMB substrate reagent kit | BD Biosciences, Mountain View, CA | #555214 | |
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #C34554 | |
RPMI 1640 medium 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #31870-025 | |
penicilline streptomycine | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15140-122 | |
Hepes Buffer | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15630-056 | |
non essential amino acids | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11140-035 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11360-039 | |
2 beta mercaptoethanol | Sigma, Saint-Louis, USA | #M3148 | |
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #65-0842-85 | |
Glutamine | Sigma, Saint-Louis, USA | #G3126 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #D1306 | |
Collagenase D | Roche Diagnostics, Germany | #11088882001 | |
EDTA | Sigma, Saint-Louis, USA | #E5134 | |
NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | #B230561 | |
Magnetic dynabeads | Dynal, Invitrogen | #11033 | Goat anti-mouse IgG |
One Comp eBeads | Ebiosciences, San Diego, USA | #01-1111-42 | |
Betadine | Refer to the institutional guidelines | ||
Isoflurane | Refer to the institutional guidelines | ||
Naplbuphine | Refer to the institutional guidelines | ||
Terramycine | Refer to the institutional guidelines | ||
Buprenorphine | Refer to the institutional guidelines | ||
Meloxicam | Refer to the institutional guidelines | ||
Complete Freund's adjuvant | |||
Rompun | Refer to the institutional guidelines | ||
Ringer lactate | Refer to the institutional guidelines | ||
Ketamine | Refer to the institutional guidelines | ||
Red blood cell lysis solution | Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O. | ||
Collagenase D | Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS | ||
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) | Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X | ||
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) | Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution | ||
complete medium for coculture | 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS | ||
nom | company | catalog number | comments |
equipments | |||
falcon 50ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #227261 | |
falcon 15ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #188271 | |
sieve | |||
Corning plastic culture dishes | VWR, Pessac | #391-0439 | |
100µm and 60µm tissue filters | Sefar NITEX, Heiden, Switzerland | #03-100/44 and #03-60/35 | |
96 wells U bottom plates for coculture | Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning | #353077 | |
96 wells V bottom plates for FACS staining | ThermoScientifique, Danemark | #249570 | |
96 wells flat bottom ELISA plates | Nunc Maxisorb | ||
seringue for spleen crush | BD Biosciences, Mountain View, CA | #309649 | |
ELISA reader | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | |
centrifuge | |||
bain marie | |||
X rays irradiator | Lincolshire, England | Faxitron CP160 | |
solar agitator | |||
FACS Canto II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
FACS Aria II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
magnet | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | 12302D |