In Vitro e In Vivo valutazione della attività soppressiva T, B e cellule mieloidi e risposte umorali dai destinatari del trapianto
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per indurre la tolleranza nel trapianto e valutare in vitro e in vivo la capacità soppressiva delle sottopopolazioni cellulari distinti dal destinatario e lo stato immunitario del destinatario verso il donatore o antigeni esogeni.
Abstract
La principale preoccupazione nel trapianto è raggiungere tolleranza specifica attraverso l’induzione di cellule regolatorie. La comprensione dei meccanismi di tolleranza richiede modelli affidabili. Qui, descriviamo modelli di tolleranza per l’allotrapianto cardiaco nel ratto, indotto dal blocco dei segnali di costimolazione o dal upregulation di molecole immunoregulatory attraverso il trasferimento genico. Ciascuno di questi modelli ha permesso la generazione in vivo delle cellule regolatorie come cellule T regolatorie (Treg), cellule regolatorie B (Bregs) o cellule mieloidi regolatorie (RegMCs). In questo manoscritto, descriviamo due protocolli complementari che sono stati utilizzati per identificare e definire le attività di regolamentazione delle cellule in vitro e in vivo per determinare la loro responsabilità nell’induzione della tolleranza e manutenzione. In primo luogo, un’analisi in vitro soppressiva ha permesso l’identificazione rapida delle cellule con capacità soppressiva sulle risposte immunitarie effettrici in un modo dipendente dalla dose e può essere utilizzata per ulteriori analisi come citochina misura o citotossicità. In secondo luogo, il trasferimento adottivo delle cellule da un destinatario trattato tollerante a un destinatario innestato appena irradiato, evidenziate le proprietà tollerogeniche di queste cellule nel controllo delle risposte immunitarie di innesto diretto e/o conversione di nuovo cellule regolatorie ( definito tolleranza infettiva). Questi metodi non sono limitati alle cellule con noti marcatori fenotipici e possono essere esteso a qualsiasi popolazione cellulare. Inoltre, il donatore diretto allospecificity delle cellule regolatorie (un obiettivo importante nel campo) può essere valutata utilizzando le cellule erogarici di terze parti o dell’innesto sia in vitro che in vivo. Infine, per determinare la capacità di tollerogeniche specifici di queste cellule regolatorie, forniamo protocolli per valutare le risposte umorali dell’anticorpo anti-donatore e la capacità del destinatario di sviluppare risposte umorali contro gli antigeni noti nuove o ex. I modelli di tolleranza descritto possono essere utilizzati per più ulteriormente caratterizzare cellule regolatorie, per identificare nuovi biomarcatori e molecole immunoregulatory e sono adattabili ad altri modelli di trapianto o malattie autoimmuni in roditore o umano.
Introduction
L’allotrapianto cardiaco nel ratto è un modello di trapianto di organo affidabile per valutare i trattamenti di induzione di tolleranza, a decifrare i meccanismi di induzione di tolleranza e di manutenzione e ha il potenziale di indurre cellule regolatorie funzionalmente competenti e dominante. I seguenti protocolli descrivono un completamente mancata corrispondenza heterotopic cardiaco innesto da un ratto di donatore 1W (LEW.1W, RT1u) di Lewis in un topo di Lewis 1A destinatario (LEW.1A, RT1un). In questa combinazione di innesto, rigetto acuto si verifica rapidamente (in circa 7 giorni) e può essere facilmente valutata tramite innesto battendo attraverso la palpazione dell’addome. Qui vi proponiamo tre protocolli per indurre la tolleranza per l’allotrapianto cardiaco nel ratto. In questi modelli, tolleranza è indotta e/o mantenuto da tipi differenti delle cellule normativo. Primo, il blocco di CD40-CD40L interazioni con un adenovirus codifica CD40Ig (AdCD40Ig) ha indotto la generazione di CD8+ Treg in grado di indurre tolleranza quando passivamente trasferiti a destinatari secondari innestate1. Inoltre, lo svuotamento di CD8+ di cellule (con gli anticorpi anti-CD8α) AdCD40Ig-trattati destinatari generati Bregs e RegMCs2. Analisi profonda dei CD8+ Treg proprietà ha evidenziato il ruolo chiave di parecchie molecole immunoregulatory definito come interleukin-34 (IL-34) e Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Considerando che la sovraespressione di IL-34 (con un vettore AAV) indotto Treg attraverso la generazione di RegMCs, la sovraespressione di FGL-2 indotta Bregs, sottostante la complessa rete di cellule regolatorie.
Perché rigetto cronico si sviluppa lentamente ed è a lungo termine, per distinguere la tolleranza contro il rigetto cronico è necessaria un’analisi approfondita. Innesto di solito viene valutata per l’infiltrazione delle cellule, fibrosi, ispessimento della deposizione di C4d vascolare parete e complemento di immunohistology7. Mentre l’istologia metodi richiedono sacrificio animale o biopsia del trapianto, qui descriviamo un metodo semplice per valutare diverse caratteristiche del documento non autografo tollerato: l’emersione e la funzione delle cellule regolatorie e le risposte di anticorpi specifici anti-donatore di sangue campione di citometria a flusso (qui, abbiamo usato la fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS)).
Manutenzione di tolleranza per il documento non autografo dopo l’arresto del trattamento è generalmente associato con l’induzione di cellule regolatorie8. Negli ultimi decenni, gli studi focalizzati su CD4+Treg caratterizzato all’unanimità li dagli indicatori chiavi Foxp3+, CD25altoe CD127–9,10,11. Allo stesso modo, parecchi indicatori sono stati attribuiti a CD8+ Treg, come CD122+, CD28–, CD45RCbasso, PD1+e Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. nel corso degli anni, l’espressione di GITR, CTLA4 e citochine (IL-10, TGFβ, IL-34, IL 35, FGL-2) sono state inoltre associate a un Treg profilo3,4,6,13, 18,19,20,21. Tuttavia, la mancanza di popolazioni di cellule normativi emergenti, quali Bregs, RegMCs o NKTregs, marcatori specifici pertinenti. Infatti, Bregs per lo più vengono segnalati come immaturi CD24+ cellule, con espressione ambigua CD27 e, talvolta, produzione di IL-10, TGFβ o granzyme B22,23,24. La complessità del lineage delle cellule mieloidi richiede una combinazione di parecchi indicatori per definire il loro profilo normativo o proinflammatory quali CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a o CD16325,26. Infine, sono stati segnalati alcuni marcatori per identificare NKTregs come CD11b+, CD27+, TGFβ+, ma ulteriori studi sono necessari per ulteriori fenotipico descriverli27,28,29 ,30,31,32. Così, evidenze di attività soppressiva sono tenute a legittimare ulteriormente Descrizione fenotipica per l’identificazione di nuovi biomarcatori, nuovi immunoregulatory mediatori e di estendere l’ambito di nuove terapie cellulari.
Vi proponiamo due metodi complementari per valutare l’attività soppressiva delle cellule. In primo luogo, il metodo in vitro costituito da coltura soppressiva delle cellule con le cellule T effettrici con etichetta stimolate dall’antigene donatore allogenico che presenta le cellule (APCs) a diversi rapporti in 6 giorni, e analizzando l’effettore proliferazione delle cellule di T che riflette il donatore-regia di soppressione immune. Le cellule dai ratti trattati possono essere paragonate direttamente alle cellule da ratti innestati non trattata per attività soppressiva (o per qualsiasi altra popolazione di cellula regolatrice) e ingenuo in una gamma di rapporti di soppressore: effettrici. Inoltre, questo metodo non richiede alcun trapianto, e si ottengono risultati entro 6 giorni. In secondo luogo, il metodo in vivo consiste nel trasferire le cellule regolatorie previste da un ratto trattato a un destinatario innestato appena irradiato. Mentre le cellule B, cellule mieloidi o T cellule da ratti non trattati ingenuo sono generalmente in grado di inibire il rigetto acuto e di prolungare la sopravvivenza dell’innesto su trasferimento adottivo, cellule con attività soppressiva ha rafforzato dal trattato-destinatari hanno questi attributi 1,2,3,4,33. Linfopenia indotta dall’irradiazione del destinatario è consigliata per consentire passivamente trasferite cellule di rimanere inalterato da omeostasi di sangue e di padroneggiare più facilmente le risposte immunitarie anti-donatore. Per entrambi i metodi, l’utilizzo in vitro di trapianto allogeneic APC o in vivo il trasferimento adottivo di soppressiva terzi celle in destinatari innestati con un cuore di terze parti consentono analisi della specificità anti-donatore. Considerando che il metodo in vivo richiede un sostanza numero di cellule, scarsamente rappresentato sottopopolazioni delle cellule possono essere valutate più facilmente per attività soppressiva in vitro33.
Le risposte umorali possono anche essere misurate per valutare lo stato di tolleranza e il controllo di risposte anticorpali diretti verso gli antigeni erogatori. Infatti, tolleranza possa essere caratterizzato da assenza di risposta umorale verso il donatore ma conservazione della capacità per i destinatari sviluppare nuovi antigeni risposta umorale e la preservazione delle risposte di memoria. In primo luogo, il principio di rilevamento alloanticorpo è basato sul riconoscimento delle cellule del donatore da destinatari anticorpi dopo incubazione del tipo di cellula del donatore con il siero da un destinatario innestato. In secondo luogo, umorale risposte dirette agli antigeni esogeni possono essere valutata dopo stimolazione dei destinatari tollerante a lungo termine con Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) emulsionato con adiuvante di Freund completo. La presenza di anticorpi IgM e IgG specifici contro gli antigeni possa essere rilevata 4 e 13 giorni, rispettivamente, a seguito di immunizzazione, con enzima Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)34. In terzo luogo, la conservazione delle risposte di memoria immunitaria può essere valutata tramite l’iniezione di xenogeniche globuli rossi (RBCs) ai giorni -7 e + 3 di trapianto e RBCs macchiatura con destinatario siero raccolto presso days + 8 e + 17 dopo trapianto. Tutti questi metodi consentono l’identificazione di sottotipi di immunoglobuline utilizzando specifici anticorpi secondari e rapida acquisizione di risultati in meno di 1,5 h di FACS macchiatura o un paio d’ore da ELISA.
Infine, questi protocolli sono progettati per la caratterizzazione di modelli di trapianto e possono essere, in qualche misura, applicata ai modelli di malattia autoimmune. I principi del metodo possono essere trasposta a tutte le specie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trasferimento adottivo di totale splenocytes in un destinatario appena innestato è un modo efficace per rilevare la presenza di cellule regolatorie indotta o rafforzato da un trattamento. Linfopenia transitoria indotta per irradiazione di host promuove la sopravvivenza delle cellule dopo il trasferimento e l’istituzione di tolleranza. Inoltre, irradiazione subletale lascia tempo per cellule con proprietà tollerogeniche per convertire in nuove cellule regolatorie durante la ricostituzione immunitaria, un fenomeno chiama…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata realizzata nell’ambito del progetto Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) che è parte del programma di governo francese “Investissements d’Avenir” gestito da ANR (ANR-11-LABX-0016-01) e dal progetto IHU-Cesti finanziato anche dal ” Programma di governo francese di investissements d’Avenir”, gestito da Francese Nazionale Research Agency (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Il progetto di IHU-Cesti è anche supportato da Nantes Métropole e Région Pays de la Loire.
Materials
| animals | |||
| LEW.1W and LEW.1A rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
| BN third party donor rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
| nom | company | catalogue number | comments |
| reagents | |||
| AdCD40Ig | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
| IL34-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
| FGL2-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
| anti-TCR | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | R7/3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD25 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX39 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD8 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX8 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD45RA | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX33 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD161 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | 3.2.3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD11b/c | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX42 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-TCRgd | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | V65 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD45RC | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX22 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD4 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX35 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD45R | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554881, His24 clone | |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #112-096-071 | |
| anti-rat IgG1 | Serotec | #MCA 194 | |
| anti-rat IgG2a | Serotec | #MCA 278 | |
| anti-rat IgG2b | Serotec | #MCA 195 | |
| anti-rat IgM-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #115-095-164 | |
| streptavidin HRP | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554066 | |
| KLH | Sigma Aldrich, St. Louis, USA | #9013-72-3 | |
| PBS 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, | |
| Tween 20 | Sigma, Saint-Louis, USA | #9005-64-5 | |
| TMB substrate reagent kit | BD Biosciences, Mountain View, CA | #555214 | |
| CellTraceTM CFSE cell proliferation kit | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #C34554 | |
| RPMI 1640 medium 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #31870-025 | |
| penicilline streptomycine | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15140-122 | |
| Hepes Buffer | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15630-056 | |
| non essential amino acids | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11140-035 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11360-039 | |
| 2 beta mercaptoethanol | Sigma, Saint-Louis, USA | #M3148 | |
| Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #65-0842-85 | |
| Glutamine | Sigma, Saint-Louis, USA | #G3126 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #D1306 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics, Germany | #11088882001 | |
| EDTA | Sigma, Saint-Louis, USA | #E5134 | |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | #B230561 | |
| Magnetic dynabeads | Dynal, Invitrogen | #11033 | Goat anti-mouse IgG |
| One Comp eBeads | Ebiosciences, San Diego, USA | #01-1111-42 | |
| Betadine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Isoflurane | Refer to the institutional guidelines | ||
| Naplbuphine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Terramycine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Buprenorphine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Meloxicam | Refer to the institutional guidelines | ||
| Complete Freund's adjuvant | |||
| Rompun | Refer to the institutional guidelines | ||
| Ringer lactate | Refer to the institutional guidelines | ||
| Ketamine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Red blood cell lysis solution | Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O. | ||
| Collagenase D | Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS | ||
| PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) | Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X | ||
| CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) | Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution | ||
| complete medium for coculture | 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS | ||
| nom | company | catalog number | comments |
| equipments | |||
| falcon 50ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #227261 | |
| falcon 15ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #188271 | |
| sieve | |||
| Corning plastic culture dishes | VWR, Pessac | #391-0439 | |
| 100µm and 60µm tissue filters | Sefar NITEX, Heiden, Switzerland | #03-100/44 and #03-60/35 | |
| 96 wells U bottom plates for coculture | Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning | #353077 | |
| 96 wells V bottom plates for FACS staining | ThermoScientifique, Danemark | #249570 | |
| 96 wells flat bottom ELISA plates | Nunc Maxisorb | ||
| seringue for spleen crush | BD Biosciences, Mountain View, CA | #309649 | |
| ELISA reader | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | |
| centrifuge | |||
| bain marie | |||
| X rays irradiator | Lincolshire, England | Faxitron CP160 | |
| solar agitator | |||
| FACS Canto II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
| FACS Aria II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
| magnet | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | 12302D |
References
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