En mångsidig metod för mönstring proteiner och celler

Summary

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Abstract

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

Introduction

I vävnadsteknik och biosensing, förmågan att kontrollera den rumsliga organisationen av proteiner och celler på en pm skala, har blivit allt viktigare under de senaste fyra decennierna ^{1, 2, 3.} Exakt rumslig organisationen av proteiner och celler har gjort det möjligt för forskare att undersöka växelverkan mellan celler och substrat som innehåller liknande eller olika typer av celler, för att vägleda celltillväxt, och att immobilisera biomolekyler för tillverkning av biosensorer ^{4, 5, 6, 7, 8, 9.}

Nuvarande metoder för mönstring proteiner inkluderar photopatterning och mikrokontakttryckning. Photopatterning utnyttjar ljuskänsligt material som tvärbinds vid exponering för Ultren violett (UV) ljus. UV-ljus riktas mot en fotomask (bestående av genomskinliga områden med mörkare regioner för att förhindra UV-ljustransmission) orsakar tvärbindning i specifika regioner som sedan kan användas för efterföljande fastsättning av biomaterial eller celler ^{10, 11.} Medan detta system är mycket exakt och möjliggör exakt styrning av topografin av odlingsytan, är den begränsad till UV-känsliga biomolekyler som kan mönstras genom UV-strålning ^12. Microcontact utskrift är en annan populär metod för mönstring specifika proteiner ^{13, 14.} I denna metod, är en poly-dimetylsiloxan (PDMS) stämpel behandlades med en mängd olika ytmodifieringstekniker reagens innan de blötläggas i en lösning av den valda biomolekylära substratet. Det är sedan försiktigt pressas på ett täckglas eller annan yta som "stämpling" biomolekylen på odlingsytan. hoWever, är prägling begränsad till den typ av material som kan överföras samt vätbarheten av biomolekyler till ytan av PDMS stamp ^15.

Direkt mönstring av celler kan vara svårare och förlitar sig på komplexa metoder såsom omkopplingsbara substrat, stencil baserade metoder eller mönstring med specifika celladhesionsmolekyler ^{16, 17.} Dessa metoder är begränsade i sin förmåga att mönsterceller på grund av avsaknaden av kompatibla cellvidhäftnings substrat, på inkompatibilitet av processen arbeta med känsliga biologiska celler och begränsningar, inkonsekvens i reproducera mönstringen, och komplexiteten i förfarandet. Till exempel, med omkopplings substrat, anpassade substrat måste utformas för varje celltyp, att byta deras anslutning till specifika celltyper utan nedbrytning vid exponering för UV-ljus och värme som används i processen ¹⁷ < sup class = "xref"> ^{18, 19, 20.} Stencil baserade mönstring metoder är mångsidiga i sin förmåga att mönsterceller; emellertid är det svårt att tillverka PDMS stenciler vid lämpliga tjocklekar för användning ^{16, 21.} Direkt injektion av celler i PDMS mikroflödessystem kanaler har vissa fördelar, såsom: 1) underlätta vid tillverkning av mikroflödessystem kanaler och 2) lämplighet för många olika celler och substrat. Emellertid den förhärskande frågan om luftbubbla infångning under injektionsprocessen på grund av de hydrofoba egenskaperna hos PDMS utan användning av plasma rengöring, eller andra metoder för att minska luftbubblor, gör det svårt att genomgående skapa mönstrade celler på glas- eller plastytor ^21.

Arbetet expanderar vid kapillär micromolding ^{22, 23,}lass = "xref"> ^{24, 25, 26} och rapporterar en metod för att injicera protein och cellsuspensioner i mikrokanaler. Den metod som används här visar den mönstring av substrat och både direkt och indirekt mönstring av specifika celltyper. Denna teknik övervinner de höga hydrofobiciteten hos PDMS och eliminerar förekomsten av bubblor under insprutning av antingen substrat eller celler genom att dra nytta av gaspermeabiliteten hos PDMS ^27. Denna uppsats visar användningen av tekniken med flera olika substrat och celltyper. Artikeln belyser också tillverkning av formar för mjuk litografi med konventionell fotolitografi samt en enkel och billig tejp metod användbar i resurs begränsade inställningar ^{28, 29.}

Protocol

OBS: Kontakta alla relevanta säkerhetsdatablad (SDB) före användning. Några av de kemikalier som används i detta protokoll är giftiga och cancerframkallande. Använd alla lämpliga säkerhetsåtgärder (dragskåp handskfacket) och personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, handskar, laboratorierock, fullängds byxor, sluten tå skor) vid användning av giftiga eller syra / basmaterial. 1. Tillverkning av master Formar för mjuk litografi med hjälp av Fotolitografi Rita ut…

Representative Results

Denna metod tillåter mönstring av proteiner och indirekt mönstring av celler med hjälp av återvändsmikroflödessystem kanaler med dimensioner så små som 10 nm och utrustning som finns i nästan alla biologiska laboratorium så snart master mögel görs. Denna teknik kan användas med PDMS mikroflödessystem kanaler som skapas med hjälp av traditionell mjuk fotolitografi, eller med PDMS mikroflödessystem kanaler som skapas med tejp tillverkning (Figur 1) <sup cl…

Discussion

Medan konventionell fotolitografi är en väl etablerad teknik för att skapa formar för mjuk litografi, utrustning, material och färdigheter som krävs för att använda konventionell fotolitografi inte är lätt tillgängliga för de flesta laboratorier. För laboratorier utan tillgång till dessa resurser, har vi presenterat tejp tillverkning som en metod för att skapa formar med relativt enkla funktioner för mikroflödessystem enheter. Denna metod gör något laboratorium för att skapa och utnyttja mikroflödes…

Materials

CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools	Corel Corporation, Canada	X4 Version 14.0.0.701	CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device
Laser Printer HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Used to degass the PDMS mixture
Adhesive Scotch Tape	3M Product, MN	Tape 600	Used to fabricate adhesive tape Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Casting polymer
Petri Dish	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Used to keep the mold to cast with PDMS
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	Used to cut the PDMS
Tweezers	Ted Pella, CA	5627-07	Used to handle the PDMS cast during peeling
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-546-2	Used as surface to pattern the Substrate
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-544-4	Used as surface to pattern the Substrate
Rubber Roller	Dick Blick Art Materials, IL	40104-1004	Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles
Laser Mask Writer	Heidelberg Instruments, Germany	DWL66fs	Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)	EV Group, Germany	EVG 620T(B)	Used to expose the photoresist to UV light
Spin Coater Headway	Headway Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Used to spin coat the photoresist on silicon wafer
Photoresists SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Negative photoresist used for mold fabrication
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Photoresist developer
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane	UCT Specialties, PA	T2492-KG	Coat mold to avoid PDMS adhesion
Isopropanol	Sigma-Aldrich, MO	190764	Cleaning Solvent
Ethanol	Sigma-Aldrich, MO	24102	Sterilization Solvent
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer
Laminin	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Cell culture
C2C12 Myoblast cell lline	ATCC, VA	CRL-1722	Used to demonstrate C2C12 patterning
PC12 Cell Line	ATCC, VA	CRL-1721	Used to demonstrate PC12 patterning
Collagen type 1, rat tail	BD Biosciences	40236	Cell culture
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Cell culture
Horse Serum, heat inactivated	Fisher Scientific, MA	26050-070	Cell culture
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	To label cells
Calcein-AM live dead cell Assay kit	Invitrogen, MA	L-3224	Cell viability Assay
Biopsy Hole Punch	Ted Pella, CA	15110-10	Punched hole in PDMS