Hier beschrieben handelt es sich um einen inszenierten, Verhaltens-Screening-Ansatz, der verwendet werden kann, um Verbindungen zu sehen, die in vivo Wirksamkeit auf kognitiven und funktionellen motorischen Verhaltensweisen in transgenen Mausmodellen von β-Amyloidose und Tauopathie zeigen. Diese Methoden sind optimiert, um Verbindungen für die Aktivität in kurzfristigen und Arbeitsspeicheraufgaben zu screenen.
Hier beschreiben wir einen inszenierten, Verhaltenstestansatz, der zum Screening von Verbindungen verwendet werden kann, die in vivo Wirksamkeit auf kognitiven und funktionellen motorischen Verhaltensweisen in transgenen Mausmodellen von β-Amyloidose und Tauopathie zeigen. Das Paradigma beinhaltet Tests für spontane Wechsel in einem Y-Labyrinth, neuartige Objekterkennung und Gliedmaßenklammerung. Diese Tests wurden ausgewählt, weil sie: 1) die Funktion der kognitiven oder motorischen Domänen und der korrelierenden neuronalen Schaltkreise, die für den menschlichen Krankheitszustand relevant sind, abfragen, 2) klar definierte Endpunkte haben, 3) leicht umsetzbare Qualitätskontrollen, 4) Ein moderates Durchsatzformat und 5) erfordern wenig Intervention durch den Ermittler. Diese Methoden sind für Forscher, die auf der Suche nach Bildschirm für die Aktivität in kurzfristigen und Arbeitsspeicher Aufgaben oder funktionale motorischen Verhaltensweisen mit Alzheimer-Krankheit Maus Modelle verbunden sind. Die hier beschriebenen Methoden verwenden VerhaltenstestsAlter eine Reihe von verschiedenen Hirnregionen einschließlich Hippocampus und verschiedenen kortikalen Bereichen. Ermittler, die kognitive Tests wünschen, die spezifisch die von einer einzelnen Hirnregion vermittelte Kognition beurteilen, könnten diese Techniken verwenden, um andere Verhaltenstests zu ergänzen.
Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine progressive neurodegenerative Erkrankung, die zu schwächenden kognitiven Rückgang führt, der etwa 44 Millionen Menschen weltweit betrifft. Derzeit gibt es keine verfügbaren Behandlungen für AD, die krankheitsmodifiziert sind und betonen die dringende Notwendigkeit für präklinische Entdeckung von neuartigen therapeutischen Strategien für diese Krankheit. Es wurden eine Reihe von verschiedenen transgenen Mausmodellen erstellt, die verschiedene Aspekte von AD 1 , 2 zusammenfassen, einschließlich Defizite in kognitiven Domänen, die bei Patienten unterbrochen wurden 3 . Diese Mausmodelle stellen ein nützliches Werkzeug dar, um ein effizientes Screening in vivo zu ermöglichen.
Bei der Beurteilung einer Verbindung zur potenziellen In-vivo- Wirksamkeit muss ein inszeniertes Vorgehen getroffen werden, dass Bildschirme für die Wirksamkeit in geeigneten kognitiven Domänen und überwacht auch Verhaltensweisen, die die spezifischen Endpunkte beeinflussen könnten, die zu einem verwendet wurdenSsess kognition Viele transgene Mausmodelle von AD zeigen Hyperaktivität und andere Verhaltensweisen, die einen bestimmten kognitiven Test beeinträchtigen können, und verbieten ihre Verwendung in der Arzneimittel-Screening 4 . Darüber hinaus sollten für einen Ansatz, der in einer Arzneimittel-Screening-Umgebung umgesetzt werden soll, die jeweiligen Tests mindestens einen moderaten Durchsatz aufrechterhalten, klar definierte Endpunkte aufweisen und eine Prozedur, die einen minimalen Eingriff durch die Ermittler erfordert. Mit diesen Kriterien können Verhaltensbildschirme implementiert werden, die die Reproduzierbarkeit, die niedrige Intra- und Inter-Assay-Varianz und die Effektgrößen für das Compound-Screening aufweisen. Detaillierte hier sind die Methoden, die wir eingesetzt haben, um Verbindungen aufzusetzen, die wirksam sind, um die in transgenen Mausmodellen der β-Amyloidose und Tauopathie 5 , 6 vorhandenen kognitiven und motorischen Phänotypen zu mildern. Die beschriebenen Methoden werden aus häufig verwendeten Verhaltens-Paradigmen, die in der lIteratur 7 , mit spezifischen optimierungen und qualitätskontrolle, so dass sie in transgenen mausmodellen verwendet werden können, die für AD relevant sind. Dieses Protokoll kann mit einer Vielzahl von Datenerfassungs- und Analysesystemen verwendet werden und geht davon aus, dass der Ermittler über Kenntnisse der zugehörigen Software verfügt.
Bedeutung der Technik im Hinblick auf bestehende Methoden
Dieses Verfahren wurde entwickelt, um die in vivo- Aktivität von Verbindungen in transgenen Mausmodellen von & bgr; -Amyloidose und Tauopathie zu screenen. Der hier verwendete Stufenansatz sorgt für den Nachweis von wirksamen Verbindungen in kognitiven Domänen, die für AD 3 relevant sind. Darüber hinaus verwendet der hier beschriebene Ansatz Verhaltenstests, die klar definierte Endpunkte, leicht umsetzbare Qualitätskontrollen, können in einem moderaten Durchsatzformat durchgeführt werden und erfordern wenig Intervention vom Ermittler. Diese Eigenschaften führen zu Assays, die eine gute Reproduzierbarkeit innerhalb von Tieren und über Kohorten aufweisen, was zu niedrigen Intra- und Inter-Assay-Varianzen und Effektgrößen (2 ≤ f ≤ 6) führt, die robust genug sind, um die Verhaltensprofilierung in einer Wirkstoffforschungsumgebung zu unterstützen.
Kritische Schritte innerhalb der PrOtocol
Viele Mausmodelle im Einsatz für AD-Arzneimittel-Entdeckung zeigen Verhaltensweisen im Einklang mit erhöhter Angst und Aggression. Dies macht die Handhabungsgewohnheit für die Durchführung der hier beschriebenen Verhaltenstests wesentlich. Da diese Tests auf unmotivierte Verhaltensweisen beruhen, kann die grobe Behandlung durch den Ermittler aufgrund einer hyperaktiven und ängstlichen oder aggressiven Maus die Leistung erheblich beeinflussen. Eine erhöhte Angst könnte dazu führen, dass die Aufgabe nicht erfüllt wird, wodurch die Gesamtleistung des Tests reduziert wird. Darüber hinaus sind Lichtniveaus in der Arena wesentlich für die Erleichterung der spontanen Fortbewegung, die für jeden Test benötigt wird. Helles Licht neigt dazu, die Angst zu erhöhen und die Fortbewegung bei Nagetieren zu unterdrücken, daher ist darauf zu achten, dass die Umgebungslichtpegel auf 30-35 Lux in der Arena eingestellt werden.
Ein weiterer kritischer Aspekt des Verfahrens ist die Minimierung von starken Umwelteinflüssen, die die Fähigkeit eines Tieres, die Aufgaben zu erfüllen, beeinträchtigen würden. Reinigung derArena und Gegenstände zwischen den Läufen ist wichtig, da Mäuse auf neuartige Düfte in der Umgebung angezogen sind. Das Versagen, die Arena gründlich zu reinigen, und Gegenstände könnten dazu führen, dass die spontane Aktivität der Maus verschoben und die wahren kognitiven Fähigkeiten maskiert wird. Die Ermittler sollten auch die Verwendung von Hygieneprodukten und Colognes / Parfums bei der Durchführung dieser Verfahren minimieren. Schließlich zeigen Nagetiere robuste tägliche und zirkadiane Veränderungen in vielen offenen Verhaltensweisen 20 einschließlich Lernen und Gedächtnis 21 . Deshalb, um die Abweichung aufgrund der täglichen Rhythmen in basalen Verhaltensweisen und kognitiven Leistungen zu minimieren, sollten alle Tests zur gleichen Zeit des Tages über Kohorten und Studien durchgeführt werden.
Weiterhin sind insbesondere im Hinblick auf die neuartige Objekterkennung das Verzögerungsintervall zwischen Abtast- und Testphase und die Auswahl und Platzierung von Objekten in der Umgebung kritische Parameter. Gedächtnis existiert in 3 verschiedenen Formen: kurzfristig memOry (STM), Zwischenspeicher (ITM) und Langzeitspeicher (LTM) 22 , 23 . Das Ändern des Intervalls zwischen Probe und Testphasen von Minuten (STM) bis Stunden (ITM) oder Tage (LTM) ändert die Art des durch die Prozedur getesteten Speichers 12 . Darüber hinaus sollten vor dem Ausführen des neuartigen Objekterkennungstests viele Objekte in einer Testkohorte von Mäusen auf potenzielle Vorspannungen bei der Exploration untersucht werden. Ein Objekt, das übermäßig attraktiv oder abstoßend für die Testkohorte ist, kann bei der Beurteilung der neuartigen Objekterkennung nicht verwendet werden. Idealerweise werden alle Objekte, die im Test eingesetzt werden, wenn sie in eine Arena gelegt werden, gleiche Erkundungszeiten aus einer naiven Mündungskohorte auslösen. Unzureichende Prüfung und Optimierung von Objekten können die Kraft der neuartigen Objekterkennung erheblich reduzieren.
Änderungen und Fehlersuche
Es gibt mehrere Faktoren, die dieScheinbare Variabilität in den hier beschriebenen kognitiven Tests. Viele Mausmodelle von AD zeigen eine hyperdynamische Fortbewegung 3 , die das Verhalten als kognitiver Endpunkt maskieren oder verändern kann. Darüber hinaus gibt es wachsende Belege dafür, dass Sex 24 , 25 , 26 und sogar mütterlicher Genotyp 27 die Entwicklung und Progression von Neuropathologie und kognitiven Phänotypen in AD-Mausmodellen beeinflussen können. Unerwartete Variabilität oder Misserfolg, eine Verhaltensaufgabe zu implementieren, könnte auf einen dieser Faktoren zurückzuführen sein. Bei der ersten Durchführung eines bestimmten Verhaltenstests sollten die Ergebnisse immer nach Geschlecht, Alter und ggf. mütterlichem Genotyp geschichtet werden. Darüber hinaus sollten die in diesem Verfahren beschriebenen Qualitätskontrollen stets durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass Hyperaktivität oder andere stereotype Verhaltensweisen die Quantifizierung kognitiver Endpunkte nicht beeinträchtigen.
EnvBügeleisen kann auch das spontane explorative Verhalten von Nagetieren beeinflussen. Duftstoffe oder Töne, die für Forscher nicht nachweisbar sind, könnten Mäuse anziehen oder abstoßen, die Ergebnisse von kognitiven Tests, die auf spontanes Verhalten beruhen, schiefen. Bei der anfänglichen Erstellung von Y-Labyrinth oder neuartiger Objekterkennung ist die Durchführung der Kontrollmaßnahmen, um sicherzustellen, dass keine Positionsvorspannungen bei der Erforschung von Objekten und / oder der Umwelt vorliegen, unerlässlich. Wenn Positionsvorspannungen beobachtet werden, müssen die Ermittler die Umwelt gründlich untersuchen und die Beleuchtung, die Arena-Platzierung, den Standort des Prüfraums im Vergleich zu anderen Räumen in der Anlage ( dh nicht in der Nähe eines hohen Traffick-Bereichs oder schwerer Ausrüstung) und Arena-Reinigungsverfahren anpassen.
Die Habituation in der Testumgebung ist der Schlüssel zur Erreichung einer optimalen Leistung im neuartigen Objekterkennungstest. Zum Beispiel können niedrige Gesamt-Explorationszeiten auf unzureichende Gewöhnung zurückzuführen sein. Als Alternative zum Proc(Abschnitt 2) und Arena (Abschnitt 4.2) Gewöhnung, Gewöhnung an Handhabung und die Testumgebung können als 3, 5 min Sitzungen pro Tag für 2 aufeinanderfolgende Tage durchgeführt werden.
Einschränkungen der Technik
Wie bei jedem Verfahren haben diese Verhaltenstests Einschränkungen. Diese Verfahren wurden eingesetzt, weil sie die Funktion verschiedener kortikaler Regionen und Hippocampus testen. Wenn das Mausmodell keine funktionalen Defizite in Hirnregionen aufweist, die durch diese Tests untersucht werden, dann sind diese Techniken nicht sinnvoll. Darüber hinaus haben wir kognitive Tests gewählt, die kurzfristiges Gedächtnis untersuchen. Wenn der Wirkmechanismus der Verbindung unter präklinischer Beurteilung nicht mit dem Kurzzeitgedächtnis behaftet wird, dann sollten diese Verfahren entsprechend modifiziert werden ( dh das Abtastprobenphasenintervall erhöhen, um den Langzeitspeicher zu testen). Schließlich verwenden diese Tests unmotivierte Verhaltensweisen. Deshalb, wenn ein Mausmodell exces istSehr hyperaktiv oder zeigt andere stereotype Verhaltensweisen, die die Erforschung der Umwelt verhindern, dann sind diese Verfahren möglicherweise nicht optimal. Als Alternative könnte man Angstkonditionierung für Tg2576 oder andere β-Amyloidose-Mausmodelle oder das räumliche Wasser-Labyrinth für rTg4510 oder andere Mausmodelle der Tauopathie verwenden 3 verwenden.
Zukünftige Anwendungen
Sobald diese Verfahren erfolgreich im Labor verabschiedet wurden, können mehrere Modifikationen oder Erweiterungen vorgenommen werden, um zusätzliche kognitive und funktionelle motorische Maßnahmen zu beurteilen. Um beispielsweise die neuartige Objekterkennungsaufgabe zu ändern, um festzustellen, ob eine Maus eine Änderung der Platzierung eines Objekts 13 erkennen kann. Alternativ könnte man statt der Verwendung von Objekten auch andere Mäuse benutzen und einen Test der gesellschaftlichen Anerkennung umsetzen. In Bezug auf die Gliedmaßenklammer und die motorische Funktion könnte man diesen Test mit den Drahtaufhängung und / oder Grifffestigkeitstests ergänzen. Die TestsDetailliert in dieser Methode bilden eine feste Basis, um für Verbindungen, die in vivo Wirksamkeit in translationalen Mausmodellen für AD haben, zu screenen und können in vielerlei Hinsicht angepasst oder modifiziert werden, um ein bestimmtes Mausmodell am besten abzufragen oder die Bedürfnisse eines einzigartigen Arzneimittelforschungsprogramms zu erfüllen .
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren haben keine Anerkennung.
Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30cm long, 10 cm wide, 20cm high walls, placed 120deg apart. | |
Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5mm Dia) glass marbles. |
Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | – | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |