Qui descritto è un approccio scenico di screening comportamentale che può essere utilizzato per la ricerca di composti che presentano l'efficacia in vivo sui comportamenti motori cognitivi e funzionali nei modelli di topi transgenici di β-amiloidosi e tauopatia. Questi metodi sono ottimizzati per schermare composti per attività in attività di memoria a breve termine e di lavoro.
Qui descriviamo un approccio sistematico di test comportamentale che può essere utilizzato per la ricerca di composti che presentano l'efficacia in vivo sui comportamenti motori cognitivi e funzionali nei modelli di topi transgenici di β-amiloidosi e tauopatia. Il paradigma include i test per l'alternanza spontanea in un labirinto Y, il nuovo riconoscimento degli oggetti e il clasping degli arti. Questi test sono stati selezionati in quanto: 1) interrogare la funzione dei domini cognitivi o motori e la circuiteria neurale correlata pertinente allo stato di malattia umana, 2) avere definiti punti definiti, 3) avere controlli di controllo di qualità facilmente implementabili, 4) essere eseguiti Un formato di throughput moderato e 5) richiedono un piccolo intervento da parte dell'investigatore. Questi metodi sono progettati per gli investigatori che cercano di schermare composti per attività in attività di memoria a breve termine o di lavoro o comportamenti motori funzionali associati ai modelli di topi di Alzheimer. I metodi qui descritti usano test comportamentali che engEtà diverse regioni del cervello, tra cui ippocampo e varie aree corticali. Gli investigatori che desiderano test cognitivi che specificamente valutano la cognizione mediata da una singola regione del cervello potrebbero utilizzare queste tecniche per completare altri test comportamentali.
La malattia di Alzheimer (AD) è un disturbo neurodegenerativo progressivo che si traduce in un debilitante declino cognitivo che colpisce circa 44 milioni di persone in tutto il mondo. Attualmente non esistono trattamenti disponibili per l'AD che sono modificando le malattie, sottolineando l'urgente necessità di scoperta preclinica di nuove strategie terapeutiche per questa malattia. Sono stati creati diversi modelli di mouse transgenici che ricapitolano vari aspetti dell'AD 1 , 2 , inclusi i disordini nei domini cognitivi interrotti nei pazienti 3 . Questi modelli di topo rappresentano uno strumento utile per facilitare lo screening efficiente in vivo .
Nel valutare un composto per un'efficacia potenziale in vivo occorre prendere in considerazione un approccio graduale che controlla l'efficacia nei domini cognitivi appropriati e controlla anche comportamenti che potrebbero influenzare gli endpoint specifici utilizzati perCognizione ssess. Molti modelli di topi transgenici di AD mostrano iperattività e altri comportamenti che possono interferire con un particolare test cognitivo e vietare il suo utilizzo nello screening della droga 4 . Inoltre, per un approccio da attuare in un ambiente di screening di droga, i particolari test utilizzati dovrebbero sostenere almeno un rendimento medio, avere punti definiti chiaramente e una procedura che richiede un minimo intervento da parte degli investigatori. Utilizzando questi criteri, possono essere implementati schermi comportamentali che presentano la riproducibilità, la bassa varianza intra-e inter-assay e le dimensioni degli effetti necessari per lo screening composto. In dettaglio qui sono i metodi che abbiamo utilizzato per la ricerca di composti efficaci per mitigare i fenotipi cognitivi e motori presenti nei modelli di topi transgenici di β-amiloidosi e tauopatia 5 , 6 . I metodi descritti sono adattati da paradigmi comportamentali comunemente usati nel lIteratura 7 , con ottimizzazioni specifiche e controlli di controllo della qualità in modo che possano essere utilizzati nei modelli di topi transgenici pertinenti all'AD. Questo protocollo può essere utilizzato con una varietà di sistemi di acquisizione dati e di analisi e suppone che l'investigatore ha una conoscenza di lavoro del software associato.
Significato della tecnica nel rispetto dei metodi esistenti
Questa procedura è stata progettata per monitorare l'attività in vivo di composti nei modelli di topi transgenici di β-amiloidosi e tauopatia. L'approccio scelto qui impiegato assicura la rilevazione di composti efficaci nei domini cognitivi rilevanti per l'AD 3 . Inoltre, l'approccio dettagliato qui utilizza test comportamentali che dispongono di endpoint chiaramente definiti, controlli di controllo di qualità facilmente implementabili, possono essere eseguiti in un formato di throughput modesto e richiedono un piccolo intervento dell'investigatore. Queste caratteristiche portano a saggi che presentano una buona riproducibilità negli animali e nelle coorte, che provoca una bassa varianza intra-e inter-assay e dimensioni di effetto (2 ≤ f ≤ 6) sufficientemente robuste per supportare la profilazione comportamentale in un ambiente di scoperta di farmaco.
Passi critici all'interno del Protocol
Molti modelli di topi utilizzati per la scoperta di farmaci AD mostrano comportamenti coerenti con l'ansia e l'aggressività aumentati. Questo rende l'abitudine di manipolazione indispensabile per eseguire uno qualsiasi dei test comportamentali descritti qui. Poiché questi test si basano su comportamenti non motivati, la manipolazione ruvida da parte dell'investigatore a causa di un topo iperattivo ed ansioso o aggressivo può influenzare notevolmente le prestazioni. L'ansia aumentata potrebbe comportare la mancata esecuzione dell'attività, riducendo la potenza complessiva del test. Inoltre, i livelli di luce nell'arena sono essenziali per facilitare la locomozione spontanea necessaria per ogni prova. La luce luminosa tende ad aumentare l'ansia e sopprimere la locomozione nei roditori, pertanto è necessario prestare attenzione a regolare i livelli di luce ambientale a 30-35 lux nell'arena.
Un altro aspetto critico della procedura è la minimizzazione di forti segnali ambientali che potrebbero interferire con la capacità di un animale di svolgere i compiti. Pulizia dellaArena e oggetti tra le piste è essenziale perché i topi sono attratti da nuovi profumi nell'ambiente. La mancata pulizia accurata dell'arena e degli oggetti potrebbe comportare un disfacimento dell'attività spontanea del mouse e la maschera delle vere prestazioni cognitive. I ricercatori dovrebbero inoltre ridurre al minimo l'uso di prodotti igienici personali e di colonia / profumi durante l'esecuzione di queste procedure. Infine, i roditori mostrano robusti cambiamenti diurni e circadiani in molti comportamenti superiori 20 tra cui l'apprendimento e la memoria 21 . Pertanto, per ridurre al minimo la varianza dovuta ai ritmi diurni nei comportamenti basali e nelle prestazioni cognitive, tutti i test devono essere eseguiti allo stesso tempo del giorno attraverso le coorti e gli studi.
Inoltre, specificamente per quanto riguarda il nuovo riconoscimento di oggetti, l'intervallo di ritardo tra il campione e la fase di test e la selezione e il posizionamento degli oggetti nell'ambiente sono parametri critici. La memoria esiste in tre forme distinte: mem. A breve termineOry (STM), memoria a termine intermedio (ITM) e memoria a lungo termine (LTM) 22 , 23 . Cambiare l'intervallo tra il campione e le fasi di test da minuti (STM) a ore (ITM) o giorni (LTM) cambierà il tipo di memoria testato dalla procedura 12 . Inoltre, prima di eseguire il nuovo test di riconoscimento degli oggetti, molti oggetti dovrebbero essere sottoposti a screening in una coorte di test di topi per potenziali pregiudizi nell'esplorazione. Un oggetto che è eccessivamente attraente o repulsivo per la coorte di prova non può essere utilizzato per la valutazione di un nuovo oggetto di riconoscimento. Idealmente tutti gli oggetti che verranno impiegati nel test, quando messi in un arena, provocheranno tempi di esplorazione uguali da una coorte ingenuo di topi. Il test e l'ottimizzazione degli oggetti inadeguati possono ridurre significativamente la potenza di un nuovo riconoscimento di oggetti.
Modifiche e risoluzione dei problemi
Ci sono diversi fattori che potrebbero aumentare il valoreVariabilità apparente nei test cognitivi qui descritti. Molti modelli di topo di AD mostrano locomozione iperdinamica 3 che possono mascherare o alterare i comportamenti misurati come endpoint cognitivo. Inoltre, vi è una crescente evidenza che il sesso 24 , 25 , 26 e addirittura genotipo materno 27 può influenzare lo sviluppo e la progressione della neuropatologia e dei fenotipi cognitivi nei modelli di topi AD. La variabilità imprevista o il mancato svolgimento di un'attività comportamentale potrebbe essere dovuta a uno di questi fattori. Quando si effettua prima una particolare prova comportamentale, i risultati devono sempre essere stratificati per sesso, età e, se applicabile, genotipo materno. Inoltre, i controlli di qualità indicati in questa procedura devono essere sempre eseguiti per garantire che iperattività o altri comportamenti stereotipati non interferiscano con la quantificazione degli endpoint cognitivi.
EnvLa stiratura può anche influenzare il comportamento esplorativo spontaneo dei roditori. Gli odori oi suoni che non sono rilevabili ai ricercatori potrebbero attirare o respingere i topi, spianando i risultati di test cognitivi che si basano sul comportamento spontaneo. Quando inizialmente stabilire un labirinto Y o un nuovo oggetto di riconoscimento, è essenziale eseguire le misure di controllo per assicurare che non ci siano pregiudizi posizionali nell'esplorazione di oggetti e / o dell'ambiente. Se si osservano biasioni posizionali, i ricercatori devono accuratamente esaminare l'ambiente e potenzialmente regolare l'illuminazione, il posizionamento dell'arena, la posizione della sala di prova rispetto ad altre sale dell'impianto ( cioè , non vicino ad un'area alta traffico o attrezzature pesanti) e alle procedure di pulizia dell'arena.
L'abituale all'ambiente di test è fondamentale per ottenere prestazioni ottimali nel nuovo test di riconoscimento degli oggetti. Ad esempio, i tempi di esplorazione bassi possono essere dovuti a un inadeguato abitudine. In alternativa al procLe istruzioni descritte qui per la manipolazione (sezione 2) e l'arena (sezione 4.2), l'abitudine alla manipolazione e l'ambiente di prova possono essere eseguite come sessioni di 3, 5 minuti al giorno per 2 giorni consecutivi.
Limitazioni della tecnica
Come per qualsiasi procedura, questi test comportamentali hanno limitazioni. Queste procedure sono state impiegate perché testano la funzione di varie regioni corticali e ippocampo. Se il modello del mouse non presenta deficit funzionali nelle regioni del cervello esaminate da questi test, queste tecniche non saranno utili. Inoltre, abbiamo scelto test cognitivi che sondano la memoria a breve termine. Se non si prevede che il meccanismo d'azione del composto sotto la valutazione preclinica possa influire sulla memoria a breve termine, queste procedure vanno modificate di conseguenza ( ad esempio , aumentando l'intervallo di fase di prova del campione per testare la memoria a lungo termine). Infine, questi test utilizzano comportamenti non motivati. Pertanto, se un modello del mouse è excesIngenue o visualizza altri comportamenti stereotipati che impediscono l'esplorazione dell'ambiente, allora queste procedure potrebbero non essere ottimali. In alternativa, si potrebbe usare il condizionamento della paura per Tg2576 o altri modelli di topi β-amiloidosi, o il labirinto dell'acqua spaziale per rTg4510 o altri modelli di topo della tauopatia 3 .
Applicazioni future
Una volta che queste procedure sono state adottate con successo nel laboratorio, diverse modifiche o estensioni possono essere effettuate per valutare ulteriori misure motorie cognitive e funzionali. Ad esempio, modificare l'attività di riconoscimento oggetto nuovo per determinare se un mouse può riconoscere una modifica nel posizionamento di un oggetto 13 . In alternativa, invece di utilizzare oggetti, si potrebbe usare altri topi e implementare una prova di riconoscimento sociale. Per quanto riguarda la chiusura degli arti e la funzione del motore, si potrebbe integrare tale prova con i test di tenuta e / o di forza della presa. I testDettagliate in questo metodo formano una base solida per schermare i composti che hanno efficacia in vivo nei modelli di topo di traslazione per AD e possono essere adattati o modificati in molti modi per interrogare meglio un particolare modello del mouse o soddisfare le esigenze di un unico programma di scoperta di droga .
The authors have nothing to disclose.
Gli autori non hanno alcun riconoscimento.
Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30cm long, 10 cm wide, 20cm high walls, placed 120deg apart. | |
Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5mm Dia) glass marbles. |
Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | – | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |