Se describe aquí un enfoque de detección de comportamiento escalonado que puede usarse para detectar compuestos que exhiben eficacia in vivo en comportamientos motores cognitivos y funcionales en modelos de ratón transgénicos de beta – amiloidosis y tauopatía. Estos métodos se optimizan para examinar los compuestos para la actividad en tareas de memoria de trabajo y de corto plazo.
Aquí se describe un método de prueba de comportamiento escalonado que se puede utilizar para la detección de compuestos que muestran eficacia in vivo en los comportamientos motores cognitivos y funcionales en modelos de ratones transgénicos de β-amiloidosis y tauopatía. El paradigma incluye pruebas para la alternancia espontánea en un laberinto en Y, un nuevo reconocimiento de objetos y un agarre de miembros. Estas pruebas fueron seleccionadas porque: 1) interrogan la función de los dominios cognitivos o motores y los circuitos neuronales correlativos relevantes para el estado de la enfermedad humana, 2) tienen puntos finales claramente definidos, 3) tienen control de calidad fácilmente implementable, 4) pueden ser ejecutados en Un formato de rendimiento moderado, y 5) requieren poca intervención del investigador. Estos métodos están diseñados para los investigadores que buscan examinar compuestos para la actividad en tareas de memoria a corto plazo y de trabajo, o comportamientos motores funcionales asociados con los modelos de ratón de la enfermedad de Alzheimer. Los métodos descritos aquí utilizan pruebas de comportamiento que engEdad una serie de diferentes regiones del cerebro, incluyendo el hipocampo y varias áreas corticales. Los investigadores que desean pruebas cognitivas que evalúan específicamente la cognición mediada por una sola región del cerebro podrían usar estas técnicas para complementar otras pruebas de comportamiento.
La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo progresivo que resulta en debilitante deterioro cognitivo que afecta a aproximadamente 44 millones de personas en todo el mundo. Actualmente no existen tratamientos disponibles para la EA que sean modificadores de la enfermedad, haciendo hincapié en la necesidad urgente de descubrir preclínicamente nuevas estrategias terapéuticas para esta enfermedad. Se han creado varios modelos de ratones transgénicos diferentes que recapitulan varios aspectos de AD 1 , 2 , incluyendo déficit en dominios cognitivos alterados en pacientes 3 . Estos modelos de ratón representan una herramienta útil para facilitar la selección eficiente in vivo .
Cuando se evalúa un compuesto para la eficacia potencial in vivo , se debe tomar un enfoque escalonado que analiza la eficacia en dominios cognitivos apropiados y también monitorea comportamientos que podrían influir en los puntos finales específicosSsess cognición. Muchos modelos de ratones transgénicos de AD exhiben hiperactividad y otros comportamientos que pueden interferir con una determinada prueba cognitiva, y prohibir su uso en la detección de drogas 4 . Además, para que un enfoque se implemente en un entorno de detección de fármacos, las pruebas particulares utilizadas deben mantener al menos un rendimiento moderado, tener puntos finales claramente definidos y un procedimiento que requiere una intervención mínima de los investigadores. Utilizando estos criterios, se pueden implementar pantallas de comportamiento que exhiben la reproducibilidad, la baja varianza intra e inter-ensayo y los tamaños de efecto necesarios para el cribado compuesto. Detallado aquí son los métodos que hemos empleado para la detección de compuestos eficaces en la mitigación de los fenotipos cognitivos y motores presentes en los modelos de ratones transgénicos de β-amiloidosis y tauopatía [ 5 , 6] . Los métodos descritos se adaptan de los paradigmas de comportamiento comúnmente usadosIteratura 7 , con optimizaciones específicas y controles de control de calidad para que puedan ser utilizados en modelos de ratones transgénicos relevantes para AD. Este protocolo puede usarse con una variedad de sistemas de adquisición y análisis de datos y asume que el investigador tiene un conocimiento práctico del software asociado.
Significado de la técnica con respecto a los métodos existentes
Este procedimiento ha sido diseñado para detectar la actividad in vivo de compuestos en modelos de ratón transgénicos de beta – amiloidosis y tauopatía. El enfoque escalonado empleado aquí asegura la detección de compuestos eficaces en los dominios cognitivos relevantes para AD 3 . Además, el enfoque detallado aquí utiliza pruebas de comportamiento que tienen puntos finales claramente definidos, controles de control de calidad fácilmente implementables, se pueden ejecutar en un formato de rendimiento moderado y requieren poca intervención del investigador. Estas características resultan en ensayos que muestran una buena reproducibilidad dentro de los animales y entre cohortes, lo que resulta en una varianza intra e inter-ensayo baja y tamaños de efecto (2 ≤ f ≤6) suficientemente robustos para soportar el perfil conductual en un ambiente de descubrimiento de fármacos.
Pasos críticos dentro del PrOtocolo
Muchos modelos de ratón en uso para el descubrimiento de fármacos de AD muestran comportamientos consistentes con una mayor ansiedad y agresividad. Esto hace que la habituación de manejo sea esencial para realizar cualquiera de las pruebas de comportamiento descritas aquí. Como estas pruebas se basan en comportamientos desmotivados, el manejo brusco por el investigador debido a un ratón hiperactivo y ansioso o agresivo puede influir significativamente en el rendimiento. El aumento de la ansiedad podría resultar en la falta de realización de la tarea, reduciendo el poder general de la prueba. Además, los niveles de luz en la arena son esenciales para facilitar la locomoción espontánea necesaria para cada prueba. Luz brillante tiende a aumentar la ansiedad y suprimir la locomoción en los roedores, por lo tanto, se debe tener cuidado de ajustar los niveles de luz ambiente a 30-35 lux en la arena.
Otro aspecto crítico del procedimiento es la minimización de señales ambientales fuertes que podrían interferir con la capacidad de un animal para realizar las tareas. Limpieza delArena y objetos entre las carreras es esencial ya que los ratones son atraídos a nuevos aromas en el medio ambiente. Si no se limpia a fondo la arena y los objetos, la actividad espontánea del ratón puede ser sesgada y se puede enmascarar el verdadero rendimiento cognitivo. Los investigadores también deben minimizar el uso de productos de higiene personal y colonias / perfumes al realizar estos procedimientos. Por último, los roedores presentan fuertes cambios diurnos y circadianos en muchos comportamientos abiertos 20, incluyendo el aprendizaje y la memoria 21 . Por lo tanto, para minimizar la varianza debido a los ritmos diurnos en los comportamientos basales y el rendimiento cognitivo, todas las pruebas deben hacerse a la misma hora del día entre cohortes y estudios.
Además, específicamente con respecto al nuevo reconocimiento de objeto, el intervalo de retardo entre la muestra y la fase de prueba, y la selección y colocación de objetos en el entorno son parámetros críticos. La memoria existe en 3 formas distintas: mem(STM), memoria de término intermedio (ITM) y memoria a largo plazo (LTM) 22 , 23 . Cambiar el intervalo entre la muestra y las fases de prueba de minutos (STM) a horas (ITM) o días (LTM) cambiará el tipo de memoria probada por el procedimiento 12 . Además, antes de ejecutar la nueva prueba de reconocimiento de objetos, muchos objetos deben ser examinados en una cohorte de pruebas de ratones para sesgos potenciales en la exploración. Un objeto que es excesivamente atractivo o repulsivo para la cohorte de prueba no puede ser utilizado al evaluar el reconocimiento de objetos nuevos. Idealmente, todos los objetos que se emplearán en la prueba, cuando se colocan en una arena, obtendrán tiempos de exploración iguales de una cohorte ingenua de ratones. Pruebas inadecuadas y optimización de objetos pueden reducir significativamente el poder del nuevo reconocimiento de objetos.
Modificaciones y solución de problemas
Hay varios factores que podrían aumentar laAparente variabilidad en las pruebas cognitivas aquí descritas. Muchos modelos de ratón de AD exhiben locomoción hiperdinámica 3 que puede enmascarar o alterar comportamientos medidos como el punto final cognitivo. Además, hay evidencia creciente de que el sexo 24 , 25 , 26 e incluso el genotipo 27 materno pueden influir en el desarrollo y progresión de neuropatología y fenotipos cognitivos en modelos de ratones AD. La variabilidad inesperada o el fracaso en la implementación de una tarea de comportamiento podría deberse a cualquiera de estos factores. Cuando se implementa una prueba conductual en particular, los resultados deben estratificarse siempre por sexo, edad y, si procede, genotipo materno. Además, los controles de calidad descritos en este procedimiento siempre deben realizarse para asegurar que la hiperactividad u otros comportamientos estereotipados no interfieran con la cuantificación de los puntos finales cognitivos.
EnvEl endurecimiento también puede influir en el comportamiento exploratorio espontáneo de los roedores. Los olores o sonidos que son indetectables para los investigadores podrían atraer o repeler a los ratones, sesgando los resultados de las pruebas cognitivas que se basan en el comportamiento espontáneo. Al establecer inicialmente el laberinto en Y o el reconocimiento de objetos novedosos, el desempeño de las medidas de control para asegurar que no hay sesgos de posición en la exploración de objetos y / o el ambiente es esencial. Si se observan sesgos de posición, los investigadores deben examinar minuciosamente el ambiente y potencialmente ajustar la iluminación, la colocación de la arena, la ubicación de la sala de pruebas en relación con otras salas de la instalación ( es decir , no cerca de un área de tráfico alto o equipo pesado)
La habituación al entorno de prueba es clave para lograr un rendimiento óptimo en la nueva prueba de reconocimiento de objetos. Por ejemplo, los tiempos de exploración totales bajos pueden deberse a una habituación inadecuada. Como alternativa al proc(Sección 2) y la ambientación (sección 4.2), la habituación a la manipulación y el ambiente de prueba se pueden realizar como sesiones de 3, 5 minutos por día durante 2 días consecutivos.
Limitaciones de la técnica
Como con cualquier procedimiento, estas pruebas de comportamiento tienen limitaciones. Estos procedimientos se han empleado porque prueban la función de varias regiones corticales y el hipocampo. Si el modelo de ratón no presenta déficit funcional en las regiones del cerebro probadas por estas pruebas, entonces estas técnicas no serán útiles. Además, hemos elegido pruebas cognitivas que sondean la memoria a corto plazo. Si no se espera que el mecanismo de acción del compuesto bajo evaluación preclínica afecte la memoria a corto plazo, estos procedimientos deben ser modificados en consecuencia ( es decir , aumentando el intervalo de fase de prueba de muestra para probar la memoria a largo plazo). Por último, estas pruebas usan comportamientos desmotivados. Por lo tanto, si un modelo de ratón es excesSivamente hiperactiva o muestra otros comportamientos estereotipados que impiden la exploración del medio ambiente, entonces estos procedimientos podrían no ser óptimos. Como alternativa, se podría utilizar el miedo acondicionado para Tg2576 u otros β-amiloidosis ratón modelos, o el laberinto de agua espacial para rTg4510 u otros modelos de ratones de tauopatía [ 3] .
Aplicaciones futuras
Una vez que estos procedimientos se han adoptado con éxito en el laboratorio, se pueden hacer varias modificaciones o extensiones para evaluar las medidas motoras cognitivas y funcionales adicionales. Por ejemplo, cambiar la tarea de reconocimiento de objetos noveles para determinar si un ratón puede reconocer un cambio en la colocación de un objeto 13 . Alternativamente, en lugar de usar objetos, uno podría usar otros ratones e implementar una prueba de reconocimiento social. Con respecto a la sujeción de las extremidades y la función motora, se podría complementar esa prueba con las pruebas de resistencia al agarre y / o de la tensión del cable. Los exámenesDetalladas en este método forman una base sólida para cribar compuestos que tienen eficacia in vivo en modelos de ratón de traducción para AD y pueden adaptarse o modificarse de muchas maneras para interrogar mejor un modelo de ratón particular o satisfacer las necesidades de un programa único de descubrimiento de fármacos .
The authors have nothing to disclose.
Los autores no tienen reconocimientos.
Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30cm long, 10 cm wide, 20cm high walls, placed 120deg apart. | |
Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5mm Dia) glass marbles. |
Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | – | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |