Hier beschreven is een gestage, gedrags screening aanpak die kan worden gebruikt om te screenen voor verbindingen die in vivo werkzaamheid vertonen op cognitief en functioneel motorisch gedrag bij transgene muismodellen van β-amyloïdose en tauopathie. Deze methoden zijn geoptimaliseerd om verbindingen te screenen voor activiteit in kort- en werkgeheugen taken.
Hier beschrijven we een gestage, gedragstestende aanpak die kan worden gebruikt om te screenen voor verbindingen die in vivo werkzaamheid vertonen op cognitief en functioneel motorisch gedrag bij transgene muismodellen van β-amyloïdose en tauopathie. Het paradigma omvat tests voor spontane afwisseling in een Y-doolhof, nieuwe objectherkenning, en ledematen. Deze tests werden geselecteerd omdat zij: 1) de functie van cognitieve of motorische domeinen en de correlate neurale schakeling die relevant zijn voor de menselijke ziekte staat, 2) duidelijk gedefinieerde eindpunten hebben, 3) gemakkelijk te kunnen uitvoeren kwaliteitscontroles, 4) kunnen worden uitgevoerd in Een gematigd doorvoerformaat, en 5) weinig interventie door de onderzoeker vereisen. Deze methoden zijn ontworpen voor onderzoekers die verbindingen zoeken voor activiteiten op korte termijn en werkgeheugen, of functionele motorische gedragingen in verband met Alzheimer's ziekte-muismodellen. De hier beschreven methoden gebruiken gedragstests die engLeeftijd een aantal verschillende hersenregio's, waaronder hippocampus en diverse corticale gebieden. Onderzoekers die cognitieve tests verlangen die specifiek beoordelen van cognitie gemedieerd door een enkele hersengebied, kunnen deze technieken gebruiken om andere gedragstests aan te vullen.
Alzheimer's ziekte (AD) is een progressieve neurodegeneratieve stoornis, wat leidt tot een verzwakking van de cognitieve afname die ongeveer 44 miljoen mensen wereldwijd beïnvloedt. Momenteel zijn er geen beschikbare behandelingen voor AD die ziekteveranderend zijn, met nadruk op de dringende behoefte aan preklinische ontdekking van nieuwe therapeutische strategieën voor deze ziekte. Er zijn een aantal verschillende transgene muismodellen gecreëerd die verschillende aspecten van AD 1 , 2 samenvatten, inclusief tekorten in cognitieve domeinen die bij patiënten 3 zijn verstoord. Deze muismodellen vormen een handig hulpmiddel voor het vergemakkelijken van efficiënte screening in vivo .
Bij het beoordelen van een verbinding voor mogelijke in vivo werkzaamheid, moet een opstelling worden uitgevoerd die scherpt voor werkzaamheid in geschikte cognitieve domeinen en ook gedrag controleert die de specifieke eindpunten die gebruikt kunnen worden voor eenSsess cognitie. Veel transgene muismodellen van AD tonen hyperactiviteit en andere gedragingen die een bepaalde cognitieve test kunnen bemoeien, en het gebruik ervan verbieden bij drugscreening 4 . Bovendien, voor een aanpak die in een drugscreeningomgeving moet worden uitgevoerd, dienen de gebruikte tests ten minste een matige doorvoer te hebben, duidelijk gedefinieerde eindpunten en een procedure die minimale interventie door de onderzoekers vereist. Met behulp van deze criteria kunnen gedragscreens geïmplementeerd worden die de reproduceerbaarheid, de lage intra- en interassay variantie en effectgroottes tonen die nodig zijn voor samengestelde screening. Gedetailleerd hier zijn de methoden die we hebben toegepast om te screenen voor verbindingen die effectief zijn om de cognitieve en motorfenotypen die aanwezig zijn in transgene muismodellen van β-amyloïdose en tauopathie 5 , 6 te verminderen. De beschreven methoden zijn aangepast aan veelgebruikte gedragsparadigma's die in de l worden gerapporteerdIteratuur 7 , met specifieke optimalisaties en kwaliteitscontroles, zodat ze gebruikt kunnen worden in transgene muismodellen die relevant zijn voor AD. Dit protocol kan worden gebruikt met een verscheidenheid aan data-acquisitie- en analysesystemen en veronderstelt dat de onderzoeker over de nodige kennis van de bijbehorende software beschikt.
Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande methoden
Deze procedure is ontworpen om te screenen voor in vivo activiteit van verbindingen in transgene muismodellen van β-amyloïdose en tauopathie. De hier in gebruik getreden benadering zorgt voor detectie van effectieve verbindingen in cognitieve domeinen die relevant zijn voor AD 3 . Bovendien gebruikt de hier beschreven aanpak gedragstesten die duidelijk gedefinieerde eindpunten hebben, gemakkelijk te implementeren kwaliteitscontroles, kunnen worden uitgevoerd in een gematigd doorvoervorm, en vereisen weinig interventie van de onderzoeker. Deze eigenschappen resulteren in analyses die goede reproduceerbaarheid vertonen binnen dieren en over cohorten, wat resulteert in lage intra- en interassay variantie en effectgroottes (2 ≤ f ≤ 6 ) die robuust genoeg zijn om gedragsprofielen te ondersteunen in een drug ontdekkingsomgeving.
Critische stappen binnen de Protocol
Veel muismodellen in gebruik voor AD drug ontdekking tonen gedrag in overeenstemming met verhoogde angst en agressie. Dit maakt het hanteren van wabituatie essentieel voor het uitvoeren van een van de hier beschreven gedragstests. Aangezien deze tests afhankelijk zijn van ongemotiveerd gedrag, kan ruwe behandeling door de onderzoeker door een hyperactieve en angstige of agressieve muis de prestatie aanzienlijk beïnvloeden. Verhoogde angst kan resulteren in het niet uitvoeren van de taak, waardoor de totale kracht van de test wordt verminderd. Bovendien zijn lichte niveaus in de arena essentieel voor het vergemakkelijken van de spontane beweging die nodig is voor elke test. Helder licht heeft de neiging om angst te verhogen en de voortbeweging bij knaagdieren te onderdrukken. Daarom moet er rekening worden gehouden met omgevingslichtniveaus tot 30-35 lux in de arena.
Een ander kritisch aspect van de procedure is het minimaliseren van sterke milieueisen die het vermogen van een dier om de taken te verrichten zouden kunnen bemoeien. Reiniging van deArena en voorwerpen tussen ritten is essentieel, omdat muizen aangetrokken zijn tot nieuwe geuren in het milieu. Als de arena niet grondig wordt gereinigd en objecten kunnen leiden tot spontane werking van de muis en de ware cognitieve prestaties maskeren. Onderzoekers moeten ook bij het uitvoeren van deze procedures gebruik maken van persoonlijke hygiëneproducten en colognes / parfums. Ten slotte vertoont knaagdieren robuuste dag- en circadiaanse veranderingen in veel open gedrag 20 waaronder leer en geheugen 21 . Daarom, om de variatie te beperken als gevolg van dagritmes in basaal gedrag en cognitieve prestaties, moeten alle tests op hetzelfde moment van de dag plaatsvinden over cohorten en studies.
Verder, met betrekking tot nieuwe objectherkenning, zijn de vertragingsinterval tussen sample en testfase en de selectie en plaatsing van objecten in de omgeving kritieke parameters. Geheugen bestaat in 3 verschillende vormen: korte termijn memOry (STM), intermediair term geheugen (ITM) en langdurig geheugen (LTM) 22 , 23 . Als u het interval tussen sample en testfases van minuten (STM) naar uren (ITM) of dagen (LTM) wijzigt, verandert het type geheugen dat wordt getest volgens de procedure 12 . Bovendien, voor het uitvoeren van de nieuwe object herkenningstest, moeten veel objecten worden gescreend in een testcohort van muizen voor potentiële vooroordeel bij exploratie. Een object dat overmatig aantrekkelijk of afstotend is voor de testcohort kan niet worden gebruikt bij het beoordelen van nieuwe objectherkenning. Ideaal gezien zullen alle objecten die in de test worden gebruikt, in een arena worden geplaatst, gelijke verkenningstijden opleveren uit een naïeve cohort muizen. Onvoldoende testen en optimaliseren van objecten kunnen de kracht van nieuwe objectherkenning aanzienlijk verminderen.
Wijzigingen en probleemoplossing
Er zijn verschillende factoren die het kunnen verhogenSchijnbare variabiliteit in de hier beschreven cognitieve tests. Veel muismodellen van AD tonen hyperdynamische locomotie 3 die gedrag kan gemeten of wijzigen, gemeten als het cognitieve eindpunt. Bovendien is er steeds meer bewijs dat seks 24 , 25 , 26 en zelfs genotype 27 van de moeder de ontwikkeling en progressie van neuropathologie en cognitieve fenotypen in AD-muismodellen kan beïnvloeden. Ongewenste variabiliteit of het niet uitvoeren van een gedragstaken kan het gevolg zijn van een van deze factoren. Bij de eerste implementatie van een bepaalde gedragstest dienen de resultaten altijd gestratificeerd te worden door geslacht, leeftijd en, indien van toepassing, moedergenotype. Bovendien moeten de kwaliteitscontroles die in deze procedure worden beschreven, altijd worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat hyperactiviteit of ander stereotype gedrag niet inbreuk maakt op kwantificering van cognitieve eindpunten.
envIrrigatie kan ook het spontane verkennende gedrag van knaagdieren beïnvloeden. Geuren of geluiden die niet door onderzoekers kunnen worden gedetecteerd, zouden muizen kunnen aantrekken of afstoten, scheve resultaten van cognitieve tests die op spontane gedragingen vertrouwen. Bij het oprichten van Y-doolhof of nieuwe objectherkenning is het noodzakelijk om de controlemaatregelen te verrichten om ervoor te zorgen dat er geen positiebeperkingen zijn bij het verkenning van objecten en / of milieu. Als er positiebeperkingen worden waargenomen, moeten de onderzoekers het milieu grondig onderzoeken en mogelijk verlichting, arena-plaatsing, locatie van de testkamer in vergelijking met andere ruimten in de faciliteit aanpassen ( dwz niet in de buurt van een hoge traject of zware apparatuur) en arena-reinigingsprocedures.
Houding van de testomgeving is essentieel voor het bereiken van optimale prestaties in de nieuwe objectherkenningstest. Bijvoorbeeld, lage totale exploratietijden kunnen het gevolg zijn van een onvoldoende werving. Als alternatief voor de procUitwerkingen die hier beschreven zijn voor de behandeling (sectie 2) en arena (sectie 4.2), wabituation to handling en de testomgeving kunnen gedurende 2 opeenvolgende dagen als 3, 5 minuten sessies per dag worden uitgevoerd.
Beperkingen van de techniek
Zoals bij elke procedure hebben deze gedragstests beperkingen. Deze procedures zijn toegepast omdat ze de functie van verschillende corticale gebieden en hippocampus testen. Als het muismodel geen functionele tekorten vertoont in hersengebieden die door deze tests worden getest, dan zijn deze technieken niet bruikbaar. Daarnaast hebben we cognitieve tests gekozen die korttermijn herinneren. Als het werkingsmechanisme van de verbinding onder de preklinische beoordeling niet wordt verwacht dat het kortetermijngeheugen wordt beïnvloed, dienen deze procedures dienovereenkomstig te worden gewijzigd ( dwz het verhogen van het monster-testfaseinterval om het langetermijngeheugen te testen). Ten slotte gebruiken deze tests ongemotiveerd gedrag. Daarom, als een muismodel exces isHyperactief of andere stereotype gedragingen vertoont die de verkenning van het milieu voorkomen, dan zijn deze procedures mogelijk niet optimaal. Als alternatief kan men angstconditionering gebruiken voor Tg2576 of andere β-amyloïdose-muismodellen, of het ruimtelijke waterdoolhof voor rTg4510 of andere muismodellen van tauopathie 3 .
Toekomstige Toepassingen
Zodra deze procedures succesvol zijn aangenomen in het laboratorium, kunnen verschillende wijzigingen of uitbreidingen worden aangebracht om aanvullende cognitieve en functionele motorische maatregelen te beoordelen. Bijvoorbeeld, het wijzigen van de nieuwe object herkennings taak om te bepalen of een muis een verandering in de plaatsing van een object kan herkennen 13 . Alternatief, in plaats van objecten te gebruiken, kan men andere muizen gebruiken en een test van sociale erkenning uitvoeren. Met betrekking tot de ledematen en motorfunctie kan men die test aanvullen met de draadhangen en / of gripstesttests. De testenGedetailleerd in deze methode vormen een solide basis om te screenen voor verbindingen die in vivo werkzaamheid hebben de translational muismodellen voor AD en kunnen op vele manieren aangepast of aangepast worden om een bepaald muismodel het beste te onderzoeken of aan de behoeften van een unieke drug ontdekkingsprogramma te voldoen .
The authors have nothing to disclose.
De auteurs hebben geen erkenningen.
Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30cm long, 10 cm wide, 20cm high walls, placed 120deg apart. | |
Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5mm Dia) glass marbles. |
Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | – | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |