CAPRRESI: Chimera Assembly ved Plasmid Recovery og Restriction Enzyme Site Insertion
Summary
Her præsenterer vi chimera-samling ved plasmidgenvinding og restriktionsenzym site insertion (CAPRRESI), en protokol baseret på indsættelsen af restriktionsenzymsteder i synonym-DNA-sekvenser og funktionel plasmidgenvinding. Denne protokol er en hurtig og billig metode til fusion af proteinkodende gener.
Abstract
Her præsenterer vi chimera samling ved plasmidgenvinding og restriktionsenzym site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI drager fordel af mange styrker af den oprindelige plasmidgenvindingsmetode og introducerer restriktionsenzymfordøjelse for at lette DNA-ligeringsreaktioner (kræves til chimera-samling). For denne protokol klonerer brugere wildtype gener i det samme plasmid (pUC18 eller pUC19). Efter det i silico- udvalg af aminosyresekvensregioner, hvor kimærerne skal samles, får brugerne alle de synonym-DNA-sekvenser, der koder for dem. Ad hoc Perl scripts giver brugerne mulighed for at bestemme alle synonym DNA sekvenser. Efter dette trin søger et andet Perl-script for restriktionsenzymsteder på alle synonym-DNA-sekvenser. Dette ved siliconanalyse udføres også under anvendelse af ampicillinresistensgenet ( ampR ) fundet på pUC18 / 19 plasmider. Brugere designer oligonukleotider indenfor synonymområder for at forstyrre vildtype- og ampR- gener ved hjælp af PCR. Efter obtAining og oprensning af komplementære DNA-fragmenter, opnås restriktionsenzymfordøjelse. Kimamasamling opnås ved at ligere passende komplementære DNA-fragmenter. PUC18 / 19 vektorer er valgt til CAPRRESI, fordi de tilbyder tekniske fordele, såsom lille størrelse (2.686 basepar), højt kopiantal, fordelagtige sekvenseringsreaktionsfunktioner og kommerciel tilgængelighed. Anvendelsen af restriktionsenzymer til chimærsamling eliminerer behovet for DNA-polymeraser, der giver stumpede produkter. CAPRRESI er en hurtig og billig metode til fusion af proteinkodende gener.
Introduction
Kimære gensamlinger er blevet anvendt i vid udstrækning i molekylærbiologi til at belyse proteinfunktion og / eller bioteknologiske formål. Forskellige fremgangsmåder eksisterer for fusionsgener, såsom overlappende PCR-produktamplifikation 1 , plasmidgenvinding 2 , homolog rekombination 3 , CRISPR-Cas9-systemer 4 , site-rettet rekombination 5 og Gibson-samling 6 . Hver af disse tilbyder forskellige tekniske fordele; For eksempel fleksibiliteten af overlappende PCR-design, in vivo- udvælgelsen af konstruktioner under plasmidgenvinding eller den høje effektivitet af CRISPR-Cas9 og Gibson-systemer. På den anden side kan der opstå nogle vanskeligheder under udførelse af nogle af disse metoder; For eksempel afhænger de to første tilgange på stumpede DNA-fragmenter, og ligering af disse typer produkter kan være teknisk udfordrende sammenlignet med stikKy-ended ligation. Site-directed rekombination kan efterlade spor af ekstra DNA-sekvenser (ar) på originalen, ligesom i CrexxP- systemet 5 . CRISPR-Cas9 kan undertiden ændre andre genomregioner ud over målstedet 4 .
Her introducerer vi chimera-samling ved hjælp af plasmidgendannelse og restriktionsenzym site insertion (CAPRRESI), en protokol til fusion af proteinkodende gener, der kombinerer plasmidåbningsmetoden (PRM) med indsættelsen af restriktionsenzymsteder på synonym-DNA-sekvenser, forbedrende ligeringseffektivitet . For at sikre aminosyresekvensintegriteten indsættes restriktionsenzymsteder på synonym-DNA-sekvensstrækninger. Blandt fordelene ved CAPPRESI er, at den kan udføres med almindelige laboratoriereagenser / værktøjer ( f.eks . Enzymer, kompetente celler, opløsninger og termocykler), og at det kan give hurtige resultater (når de relevante enzymer anvendes). Stole på begrænsningEnzym sites, der kommer fra synonym DNA sekvenser kan begrænse udvælgelsen af de nøjagtige fusionspunkter inden for proteiner af interesse. I sådanne tilfælde bør målgener fusioneres under anvendelse af overlappende oligonukleotider, og restriktionsenzymsteder bør indsættes på vektorens resistensgen.
CAPRRESI består af syv enkle trin ( figur 1 ): 1) udvælgelse af kloningsvektoren, pUC18 eller pUC196; 2) i silicoanalyse af vildtype-sekvenserne, der skal smeltes; 3) udvælgelse af brydningsområder for chimær samling og plasmidforstyrrelse; 4) i silico- generering af synonym-DNA-sekvenser indeholdende restriktionsenzymsteder; 5) uafhængig kloning af vildtype-generne i det valgte plasmid; 6) plasmidforstyrrelse ved PCR efterfulgt af restriktionsenzymfordøjelse; Og 7) plasmidgenvinding under anvendelse af DNA-ligering og bakteriel transformation. Kimære gener fremstillet ved denne teknik skal verificeres wEfter sekventering.
PUC18 / 19-vektorerne tilbyder tekniske fordele ved kloning og kimærsamling, såsom lille størrelse ( dvs. 2.686 basepar), højt kopiantal, fordelagtige sekvenseringsreaktionsfunktioner og kommerciel tilgængelighed 7 . Her blev en Escherichia coli vært brugt til at samle og håndtere chimærerne, fordi bakteriekulturer er billige og vokser hurtigt. På denne baggrund vil efterfølgende kloning af fusionsfragmenterne i de endelige målplasmider være nødvendige ( fx ekspressionsvektorer som pRK415 i bakterier eller pCMV i pattedyrsceller).
CAPRRESI blev testet for at fusionere to primære sigmafaktorgener: E. colirpoD og Rhizobium etlisigA . Primære sigmafaktorer er RNA-polymerasubenheder, der er ansvarlige for transkriptionsinitiering, og de består af fire domæner ( dvs. σ1, σ2, σ3 og σ4) 8 . Aminosyresekvensen længesH af proteiner kodet af rpoD og sigA er henholdsvis 613 og 685. RpoD og SigA deler 48% identitet (98% dækning). Disse primære sigmafaktorer blev opdelt i to komplementære fragmenter mellem regionerne σ2 og σ3. To kimære gener blev samlet ifølge dette design: chimera 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) og chimær 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). DNA-fusionsprodukter blev verificeret ved sekventering.
Protocol
Representative Results
Discussion
CAPRRESI blev designet som et alternativ til PRM 2 . Den oprindelige PRM er en kraftfuld teknik; Det tillader fusion af DNA-sekvenser langs enhver del af de valgte gener. For PRM bør vildtype-gener klones ind i det samme plasmid. Herefter udformes oligonukleotider inde i vildtype og antibiotikaresistensgener fundet på plasmidet. Plasmidforstyrrelse opnås ved PCR under anvendelse af stump-endede højfidelitets-DNA-polymeraser og tidligere udformede oligonukleotider. Ligeringen af kompleme…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Consejo Nacional de Ciencia og Tecnología, CONACYT, México (tilskud nr. 154833) og Universidad Nacional Autónoma de México. Forfatterne ønsker at takke Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos og Soledad Juárez for deres administrative og tekniske rådgivning.
Materials
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304011 | Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products |
| High pure plasmid isolation kit | Roche | 11754785001 | Used for all plasmid purification reactions |
| High pure PCR product purification kit | Roche | 11732676001 | Used for all PCR purification reactions from agarose gels |
| AflII restriction enzyme | New England Biolabs | R0520L | Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3142L | Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C |
| SpeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3133L | Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C |
| XbaI restriction enzyme | New England Biolabs | R0145L | Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166-5G | Antibiotics |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N8878-5G | Antibiotics |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625-1KG | Bacterial cell culture |
| Casein peptone | Sigma Aldrich | 70171-500G | Bacterial cell culture |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | Sodium chloride |
| Agar | Sigma Aldrich | 05040-1KG | Bacterial cell culture |
| XbaI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0684 | Fast digest XbaI enzyme |
| KpnI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0524 | Fast digest KpnI enzyme |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Fast DNA ligation kit |
| AflII restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0834 | Fast digest AflII enzyme |
| SpeI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD1253 | Fast digest SpeI enzyme |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Vos, M. J., Kampinga, H. H. A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes. Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).
- Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination. Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 26 (1), 101-106 (1983).
- Gruber, T. M., Gross, C. A. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Curr Protoc Bioinformatics. , 1-22 (2002).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. CSHLP. , (2001).
- Rutherford, K., et al. Artemis: sequence visualization and annotation. Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).
