CAPRRESI: Chimera Assembly Door Plasmide Recovery En Restriction Enzyme Site Insertion
Summary
Hier presenteren we chimera assemblage door plasmideherstel en restrictie-enzymplaatsinzending (CAPRRESI), een protocol gebaseerd op de invoeging van restrictie-enzymplaatsen in synoniem-DNA-sequenties en functioneel plasmideherstel. Dit protocol is een snelle en goedkope methode voor het smelten van proteïne-coderende genen.
Abstract
Hier presenteren we chimera assemblage door plasmide recovery en restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI profiteert van vele sterke punten van de oorspronkelijke plasmide herstel methode en introduceert restrictie enzym digestie om DNA ligatie reacties te vereenvoudigen (vereist voor chimera assemblage). Voor dit protocol, klonen gebruikers wildtype genen in hetzelfde plasmide (pUC18 of pUC19). Na de in silico selectie van aminozuursequentie gebieden waar chimera's moeten worden samengesteld, krijgen gebruikers alle synoniem-DNA-sequenties die ze coderen. Adhoc Perl scripts stellen gebruikers in staat om alle synonieme DNA sequenties te bepalen. Na deze stap zoekt een ander Perl-script naar restrictie-enzymplaatsen op alle synoniem-DNA-sequenties. Dit in silico analyse wordt ook uitgevoerd met behulp van het ampicilline resistentie gen ( ampR ) gevonden op pUC18 / 19 plasmiden. Gebruikers ontwerpen oligonucleotiden in synoniemregio's om wildtype- en ampR- genen door PCR te verstoren. Na obtAining en zuiverende complementaire DNA-fragmenten, wordt het verteren van restrictie-enzym verwezenlijkt. Chimera assemblage wordt bereikt door gelijke complementaire DNA fragmenten te ligeren. PUC18 / 19-vectoren worden geselecteerd voor CAPRRESI omdat ze technische voordelen bieden, zoals kleine grootte (2,686 basisparen), hoge kopieën, voordelige sequentie-reactie-eigenschappen en commerciële beschikbaarheid. Het gebruik van restrictie-enzymen voor chimera-assemblage elimineert de noodzaak van DNA-polymerasen die stompe producten leveren. CAPRRESI is een snelle en goedkope methode voor het smelten van proteïne-coderende genen.
Introduction
Chimerische gensamenstelling is veel gebruikt in moleculaire biologie om eiwitfunctie en / of biotechnologische doeleinden te verklaren. Verschillende methoden bestaan voor het smelten van genen, zoals overlappende PCR product amplificatie 1 , plasmide recovery 2 , homologe recombinatie 3 , CRISPR-Cas9 systemen 4 , site gerichte recombinatie 5 en Gibson assemblage 6 . Elk van deze biedt verschillende technische voordelen; Bijvoorbeeld de flexibiliteit van overlappende PCR-ontwerpen, de in vivo selectie van constructies tijdens plasmideherstel, of het hoge efficiëntie van CRISPR-Cas9 en Gibson systemen. Aan de andere kant kunnen sommige moeilijkheden optreden tijdens het uitvoeren van sommige van deze methoden; Bijvoorbeeld zijn de eerste twee benaderingen gebaseerd op stompe DNA-fragmenten, en ligatie van deze typen producten kan technisch uitdagend zijn in vergelijking met sticKy-ended ligatie. Site-gerichte recombinatie kan sporen van extra DNA-sequenties (littekens) op het origineel achterlaten, zoals in het CrexloP-systeem 5 . CRISPR-Cas9 kan in aanvulling op de doelplaats 4 soms andere genoomgebieden wijzigen.
Hier introduceren we chimera assemblage door plasmideherstel en restrictie-enzymplaatsinvoeging (CAPRRESI), een protocol voor het smelten van proteïne-coderende genen die de plasmideherstelmethode (PRM) combineren met de insertie van restrictie-enzymplaatsen op synoniem-DNA-sequenties, het verbeteren van de ligatie-efficiëntie . Om de aminozuursequentie integriteit te waarborgen, worden restrictie-enzymplaatsen ingevoegd op synoniem-DNA-sequentiestrektes. Onder de voordelen van CAPPRESI is dat het kan worden uitgevoerd met behulp van gewone laboratoriumreagentia / gereedschappen ( bijv . Enzymen, bevoegde cellen, oplossingen en thermocycler) en dat het snelle resultaten kan geven (wanneer de juiste enzymen worden gebruikt). Vertrouwen op beperkingEnzym sites die voortkomen uit synonieme DNA sequenties kunnen de selectie van de exacte fusiepunten binnen de eiwitten van belang beperken. In dergelijke gevallen moeten doelgenen worden gefuseerd met behulp van overlappende oligonucleotiden, en restrictie-enzymplaatsen moeten op het weerstandgen van de vector worden ingebracht.
CAPRRESI bestaat uit zeven eenvoudige stappen ( Figuur 1 ): 1) selectie van de kloningsvector, pUC18 of pUC196; 2) in silico analyse van de wildtype sequenties die gefuseerd moeten worden; 3) selectie van breekgebieden voor chimera assemblage en plasmid ontwrichting; 4) in silico generatie van synoniem-DNA sequenties die restrictie-enzym sites bevatten; 5) onafhankelijk klonen van de wildtype genen in het geselecteerde plasmide; 6) plasmidestoring door PCR, gevolgd door restrictie-enzymvertering; En 7) plasmideherstel met behulp van DNA-ligatie en bacteriële transformatie. Chimerische genen geproduceerd door deze techniek moeten worden gecontroleerd wIn sequentiebepaling.
De vectoren pUC18 / 19 bieden technische voordelen voor het klonen en chimera assemblage, zoals kleine grootte ( dwz 2,686 basisparen), hoge kopieën, voordelige sequentie-reactie-eigenschappen en commerciële beschikbaarheid 7 . Hier werd een Escherichia coli gastheer gebruikt om de chimera's te monteren en te behandelen, omdat bacteriële culturen goedkoop zijn en snel groeien. Gezien dit, zal verdere cloning van de fusiefragmenten in de uiteindelijke doelplasmiden nodig zijn ( bijv. Expressievectoren als pRK415 in bacteriën of pCMV in zoogdiercellen).
CAPRRESI werd getest op het fuseren van twee primaire sigma-factor genen: E. colirpoD en Rhizobium etlisigA . Primaire sigma factoren zijn RNA polymerase subunits die verantwoordelijk zijn voor transcriptie initiatie, en bestaan uit vier domeinen ( dwz σ1, σ2, σ3 en σ4) 8 . De aminozuursequentie verlengtH van eiwitten gecodeerd door rpoD en sigA zijn respectievelijk 613 en 685. RpoD en SigA delen 48% identiteit (98% dekking). Deze primaire sigma factoren werden gesplitst in twee complementaire fragmenten tussen regio's σ2 en σ3. Twee chimere genen werden samengesteld volgens dit ontwerp: chimera 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) en chimera 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). DNA-fusieproducten werden geverifieerd door sequencing.
Protocol
Representative Results
Discussion
CAPRRESI is ontworpen als een alternatief voor de PRM 2 . De originele PRM is een krachtige techniek; Het maakt het mogelijk de DNA-sequenties te combineren langs elk deel van de geselecteerde genen. Voor PRM moeten wildtype genen in hetzelfde plasmide worden gekloneerd. Daarna worden oligonucleotiden ontworpen binnen wildtype en antibiotica resistentie genen gevonden op het plasmide. Plasmidafbreking wordt bereikt door PCR met behulp van stompe, hoogwaardige DNA-polymerasen en eerder ontworpen o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Consejo Nacional de Ciencia en Tecnología, CONACYT, México (subsidie nummer 154833) en Universidad Nacional Autónoma de México. De auteurs bedanken Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos en Soledad Juárez voor hun administratief en technisch advies.
Materials
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304011 | Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products |
| High pure plasmid isolation kit | Roche | 11754785001 | Used for all plasmid purification reactions |
| High pure PCR product purification kit | Roche | 11732676001 | Used for all PCR purification reactions from agarose gels |
| AflII restriction enzyme | New England Biolabs | R0520L | Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3142L | Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C |
| SpeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3133L | Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C |
| XbaI restriction enzyme | New England Biolabs | R0145L | Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166-5G | Antibiotics |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N8878-5G | Antibiotics |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625-1KG | Bacterial cell culture |
| Casein peptone | Sigma Aldrich | 70171-500G | Bacterial cell culture |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | Sodium chloride |
| Agar | Sigma Aldrich | 05040-1KG | Bacterial cell culture |
| XbaI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0684 | Fast digest XbaI enzyme |
| KpnI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0524 | Fast digest KpnI enzyme |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Fast DNA ligation kit |
| AflII restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0834 | Fast digest AflII enzyme |
| SpeI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD1253 | Fast digest SpeI enzyme |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Vos, M. J., Kampinga, H. H. A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes. Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).
- Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination. Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 26 (1), 101-106 (1983).
- Gruber, T. M., Gross, C. A. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Curr Protoc Bioinformatics. , 1-22 (2002).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. CSHLP. , (2001).
- Rutherford, K., et al. Artemis: sequence visualization and annotation. Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).
