CAPRRESI: Assemblage de la chimère par insertion de plasmides et restriction Enzyme Site Insertion
Summary
Ici, nous présentons l'assemblage de la chimère par récupération du plasmide et l'insertion du site enzymatique de restriction (CAPRRESI), un protocole basé sur l'insertion des sites d'enzymes de restriction dans des séquences d'ADN synonymes et une récupération fonctionnelle du plasmide. Ce protocole est une méthode rapide et peu coûteuse pour fusionner des gènes codant pour des protéines.
Abstract
Ici, nous présentons l'assemblage de la chimère par récupération du plasmide et l'insertion du site enzymatique de restriction (CAPRRESI). CAPRRESI bénéficie de nombreuses forces de la méthode de récupération du plasmide d'origine et introduit une digestion enzymatique de restriction pour faciliter les réactions de ligature d'ADN (requises pour l'assemblage de la chimère). Pour ce protocole, les utilisateurs clonent des gènes de type sauvage dans le même plasmide (pUC18 ou pUC19). Après la sélection in silico des régions de séquence d'acides aminés où les chimères doivent être assemblées, les utilisateurs obtiennent toutes les séquences d'ADN synonymes qui les codent. Les scripts ad hoc Perl permettent aux utilisateurs de déterminer toutes les séquences d'ADN synonymes. Après cette étape, un autre script Perl recherche des sites d'enzymes de restriction sur toutes les séquences d'ADN synonymes. Cette analyse in silico est également effectuée en utilisant le gène de résistance à l'ampicilline ( ampR ) trouvé sur les plasmides pUC18 / 19. Les utilisateurs conçoivent des oligonucléotides dans des régions synonymes pour perturber les gènes de type sauvage et ampR par PCR. Après obtL'administration et la purification de fragments d'ADN complémentaires, la digestion enzymatique de restriction est réalisée. L'assemblage de la chimère est réalisé en ligant des fragments d'ADN complémentaires appropriés. Les vecteurs pUC18 / 19 sont sélectionnés pour CAPRRESI car ils offrent des avantages techniques, tels que la petite taille (2,686 paires de bases), le nombre élevé de copies, les caractéristiques de réaction de séquençage avantageuses et la disponibilité commerciale. L'utilisation d'enzymes de restriction pour l'assemblage de chimères élimine la nécessité d'ADN polymerases produisant des produits à extrémités franches. CAPRRESI est une méthode rapide et peu coûteuse pour fusionner des gènes codant pour des protéines.
Introduction
L'assemblage de gènes chimériques a été largement utilisé dans la biologie moléculaire pour élucider la fonction protéique et / ou à des fins biotechnologiques. Différents procédés existent pour fusionner des gènes, tels que l'amplification de produit de PCR 1 , la récupération de plasmide 2 , la recombinaison homologue 3 , les systèmes CRISPR-Cas9 4 , la recombinaison 5 dirigée par site et l'assemblage 6 de Gibson. Chacun de ces avantages offre différents avantages techniques; Par exemple, la flexibilité de la conception de la PCR en chevauchement, la sélection in vivo des constructions lors de la récupération du plasmide ou la haute efficacité des systèmes CRISPR-Cas9 et Gibson. En revanche, certaines difficultés peuvent survenir lors de l'exécution de certaines de ces méthodes; Par exemple, les deux premières approches s'appuient sur des fragments d'ADN à extrémités franches, et la ligature de ces types de produits pourrait être techniquement difficile par rapport à SticLigature ky-terminée. La recombinaison dirigée par le site peut laisser des traces de séquences supplémentaires d'ADN (cicatrices) sur l'original, comme dans le système Cre- LoxP 5 . CRISPR-Cas9 peut parfois modifier d'autres régions génomiques en plus du site cible 4 .
Ici, nous introduisons l'assemblage de chimère par récupération de plasmide et insertion de site d'enzyme de restriction (CAPRRESI), un protocole pour fusionner des gènes codant pour des protéines qui combinent la méthode de récupération de plasmide (PRM) avec l'insertion de sites d'enzymes de restriction sur des séquences d'ADN synonyme, améliorant l'efficacité de ligature . Pour assurer l'intégrité de la séquence d'acides aminés, les sites d'enzymes de restriction sont insérés sur des tronçons de séquence d'ADN synonyme. Parmi les avantages de CAPPRESI, il est possible de le faire en utilisant des réactifs / outils de laboratoire ordinaires ( par exemple , enzymes, cellules compétentes, solutions et thermocycleurs) et qu'il peut donner des résultats rapides (lorsque les enzymes appropriées sont utilisées). S'appuyant sur la restrictionLes sites enzymatiques issus des séquences d'ADN synonymes peuvent limiter la sélection des points de fusion exacts à l'intérieur des protéines d'intérêt. Dans de tels cas, les gènes cibles doivent être fusionnés en utilisant des oligonucléotides se chevauchant, et les sites d'enzymes de restriction doivent être insérés sur le gène de résistance du vecteur.
CAPRRESI se compose de sept étapes simples ( Figure 1 ): 1) sélection du vecteur de clonage, pUC18 ou pUC19 6 ; 2) analyse in silico des séquences de type sauvage à fusionner; 3) sélection des régions de rupture pour l'assemblage de la chimère et la rupture des plasmides; 4) génération in silico de séquences d'ADN synonymes contenant des sites d'enzymes de restriction; 5) clonage indépendant des gènes de type sauvage dans le plasmide sélectionné; 6) rupture de plasmide par PCR, suivie d'une digestion par une enzyme de restriction; Et 7) la récupération du plasmide en utilisant une ligature d'ADN et une transformation bactérienne. Les gènes chimériques produits par cette technique devraient être vérifiés wAvec séquençage.
Les vecteurs pUC18 / 19 offrent des avantages techniques pour le clonage et l'assemblage des chimères, tels que la petite taille ( c.-à-d., 2,686 paires de bases), le nombre élevé de copies, les caractéristiques de réaction de séquençage avantageuses et la disponibilité commerciale 7 . Ici, un hôte Escherichia coli a été utilisé pour assembler et manipuler les chimères parce que les cultures bactériennes sont bon marché et se développent rapidement. Compte tenu de cela, le clonage ultérieur des fragments de fusion dans les plasmides cible finaux sera nécessaire ( par exemple, les vecteurs d'expression comme pRK415 dans des bactéries ou pCMV dans des cellules de mammifères).
CAPRRESI a été testé pour la fusion de deux principaux gènes du facteur sigma: E. colirpoD et Rhizobium etlisigA . Les facteurs de sigma primaires sont des sous-unités de l'ARN polymérase responsables de l'initiation de la transcription, et elles sont constituées de quatre domaines ( c'est-à-dire σ1, σ2, σ3 et σ4) 8 . La séquence d'acides aminés lengtH de protéines codées par rpoD et sigA sont respectivement 613 et 685. RpoD et SigA partagent 48% d'identité (98% de couverture). Ces principaux facteurs sigma ont été divisés en deux fragments complémentaires entre les régions σ2 et σ3. Deux gènes chimériques ont été assemblés selon cette conception: la chimère 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) et la chimère 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). Les produits de fusion d'ADN ont été vérifiés par séquençage.
Protocol
Representative Results
Discussion
CAPRRESI a été conçu comme une alternative au PRM 2 . Le PRM original est une technique puissante; Il permet la fusion des séquences d'ADN le long de n'importe quelle partie des gènes sélectionnés. Pour PRM, les gènes de type sauvage doivent être clones dans le même plasmide. Ensuite, les oligonucléotides sont conçus dans des gènes de résistance de type sauvage et antibiotiques trouvés sur le plasmide. La rupture des plasmides est obtenue par PCR en utilisant des ADN polym?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Conseil national de la science et la technologie, le CONACYT, le Mexique (numéro de subvention 154833) et l'Université nationale autonome du Mexique. Les auteurs souhaitent remercier Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos et Soledad Juárez pour leurs conseils administratifs et techniques.
Materials
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304011 | Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products |
| High pure plasmid isolation kit | Roche | 11754785001 | Used for all plasmid purification reactions |
| High pure PCR product purification kit | Roche | 11732676001 | Used for all PCR purification reactions from agarose gels |
| AflII restriction enzyme | New England Biolabs | R0520L | Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3142L | Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C |
| SpeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3133L | Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C |
| XbaI restriction enzyme | New England Biolabs | R0145L | Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166-5G | Antibiotics |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N8878-5G | Antibiotics |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625-1KG | Bacterial cell culture |
| Casein peptone | Sigma Aldrich | 70171-500G | Bacterial cell culture |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | Sodium chloride |
| Agar | Sigma Aldrich | 05040-1KG | Bacterial cell culture |
| XbaI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0684 | Fast digest XbaI enzyme |
| KpnI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0524 | Fast digest KpnI enzyme |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Fast DNA ligation kit |
| AflII restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0834 | Fast digest AflII enzyme |
| SpeI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD1253 | Fast digest SpeI enzyme |
References
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