CAPRRESI: Assemblaggio chimico mediante inserimento del sito enzimatico di recupero e restrizione di plasmide
Summary
Qui presentiamo l'assemblaggio di chimera mediante il recupero del plasmide e l'inserimento del sito enzimatico di restrizione (CAPRRESI), un protocollo basato sull'inserimento di siti di enzimi di restrizione in sequenze di DNA sinonimo e recupero plasmide funzionale. Questo protocollo è un metodo veloce e conveniente per fusione di geni di codifica proteica.
Abstract
Qui presentiamo l'assemblaggio di chimera mediante recupero del plasmide e inserimento del sito enzimatico di restrizione (CAPRRESI). CAPRRESI beneficia di molti punti di forza del metodo originale di recupero del plasmide e introduce la digestione dell'enzima di restrizione per facilitare le reazioni di legatura del DNA (richieste per l'assemblaggio di chimera). Per questo protocollo, gli utenti clonano i geni del wildtype nello stesso plasmide (pUC18 o pUC19). Dopo la selezione in silico di regioni di sequenze di aminoacidi in cui devono essere assemblate le chimere, gli utenti ottengono tutte le sequenze sinonime di DNA che li codificano. Gli script di Perl ad hoc consentono agli utenti di determinare tutte le sequenze di sinonimi del DNA. Dopo questo passaggio, un altro script Perl cerca siti di restrizione enzimatica su tutte le sequenze di DNA sinonimo. Questa analisi in silico viene eseguita anche utilizzando il gene di resistenza dell'ampicillina ( ampR ) trovato sui plasmidi pUC18 / 19. Gli utenti progettano oligonucleotidi all'interno delle regioni sinonime per interrompere i geni wildtype e ampR mediante PCR. Dopo obtL'integrazione e la purificazione di frammenti di DNA complementari, la digestione dell'enzima di restrizione viene completata. L'assemblaggio della chimera è ottenuto legando appropriati frammenti di DNA complementari. I vettori pUC18 / 19 sono selezionati per CAPRRESI perché offrono vantaggi tecnici, come piccole dimensioni (2.686 paia di base), numero di copie elevate, caratteristiche di reazione vantaggiosa di sequenziamento e disponibilità commerciale. L'impiego di enzimi di restrizione per l'assemblaggio di chimere elimina la necessità di DNA polimerasi che producono prodotti blunt-ended. CAPRRESI è un metodo veloce e conveniente per la fusione di geni che codificano proteine.
Introduction
Il complesso gene chimerico è stato ampiamente utilizzato nella biologia molecolare per chiarire la funzione proteica e / o per scopi biotecnologici. Esistono diversi metodi per la fusione di geni, come la sovrapposizione del prodotto PCR 1 , il recupero del plasmide 2 , la ricombinazione omologa 3 , i sistemi CRISPR-Cas9 4 , la ricombinazione localizzata 5 e l'assemblaggio Gibson 6 . Ognuna di esse offre diversi vantaggi tecnici; Per esempio la flessibilità del disegno PCR sovrapposto, la selezione in vivo di costruzioni durante il recupero del plasmide o l'alta efficienza dei sistemi CRISPR-Cas9 e Gibson. D'altra parte, alcune difficoltà possono sorgere durante l'esecuzione di alcuni di questi metodi; Per esempio, i primi due approcci si basano su frammenti di DNA a sbavature e la legatura di questi tipi di prodotti potrebbe essere tecnicamente impegnativa rispetto a quella di sticLa legatura a chiave. La ricombinazione del sito può lasciare tracce di sequenze di DNA extra (cicatrici) sull'originale, come nel sistema CreoxP 5 . CRISPR-Cas9 può talvolta modificare altre regioni del genoma oltre al sito di destinazione 4 .
Qui introduciamo l'assemblaggio di chimera mediante il recupero del plasmide e l'inserimento del sito enzimatico di restrizione (CAPRRESI), un protocollo per fusione di geni di codifica proteica che combina il metodo di recupero del plasmide (PRM) con l'inserimento di siti di enzimi di restrizione sulle sequenze di DNA sinonimo, migliorando l'efficienza di legame . Per garantire l'integrità della sequenza di aminoacidi, i siti di restrizione enzimatica vengono inseriti in sequenze di DNA sinonimo. Tra i vantaggi di CAPPRESI è che può essere eseguito utilizzando reattivi / strumenti di laboratorio ( es . Enzimi, cellule competenti, soluzioni e termociclatori) e che può dare risultati rapidi (quando vengono utilizzati gli enzimi appropriati). Basandosi sulla restrizioneI siti enzimatici che emergono dalle sequenze di DNA sinonimo possono limitare la selezione dei punti di fusione esatti all'interno delle proteine di interesse. In questi casi i geni bersaglio dovrebbero essere fusi utilizzando oligonucleotidi sovrapposti e siti di enzimi di restrizione dovrebbero essere inseriti sul gene di resistenza del vettore.
CAPRRESI è costituito da sette semplici passaggi ( Figura 1 ): 1) selezione del vettore di clonazione, pUC18 o pUC196; 2) nell'analisi siliconica delle sequenze di wildtype da fusione; 3) selezione di regioni di rottura per l'assemblaggio di chimera e la rottura del plasmide; 4) nella generazione siliconica di sequenze di DNA sinonime contenenti siti di restrizione enzimatica; 5) clonazione indipendente dei geni selvatici nel plasmide selezionato; 6) la rottura del plasmide mediante PCR, seguito da una digestione di enzimi di restrizione; E 7) recupero del plasmide utilizzando la legatura del DNA e la trasformazione batterica. I geni chimici prodotti da questa tecnica dovrebbero essere verificati wIth sequenziamento.
I vettori pUC18 / 19 offrono vantaggi tecnici per la clonazione e l'assemblaggio di chimere, quali piccole dimensioni ( cioè 2686 paia di base), numero di copie elevate, caratteristiche di reazione vantaggiosa di sequenziamento e disponibilità commerciale 7 . Qui un host di coli di Escherichia è stato usato per assemblare e gestire le chimere perché le colture batteriche sono economiche e crescono velocemente. Dato questo, sarà necessaria una successiva clonazione dei frammenti di fusione nei plasmidi target definiti ( ad esempio, vettori di espressione come pRK415 nei batteri o pCMV nelle cellule dei mammiferi).
CAPRRESI è stato testato per fusione di due geni del fattore di sigma primario: E. coliPro e Rhizobium etlisigA . I fattori sigma primari sono le subunità di polimerasi RNA responsabili dell'iniziazione della trascrizione e sono costituiti da quattro domini (σ1, σ2, σ3 e σ4) 8 . La sequenza di aminoacidi si lengtH di proteine codificate da rpoD e sigA sono rispettivamente 613 e 685. RpoD e SigA condividono l'identità del 48% (copertura del 98%). Questi fattori di sigma primario sono stati suddivisi in due frammenti complementari tra regioni σ2 e σ3. Due geni chimerici sono stati assemblati secondo questo disegno: chimera 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) e chimera 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). I prodotti di fusione del DNA sono stati verificati mediante sequenziamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
CAPRRESI è stato progettato come alternativa al PRM 2 . Il PRM originale è una tecnica potente; Consente la fusione di sequenze di DNA su qualsiasi parte dei geni selezionati. Per PRM, i geni di tipo selvatico devono essere clonati nello stesso plasmide. Dopo di che, gli oligonucleotidi sono progettati all'interno di geni selvatici e resistenti agli antibiotici trovati sul plasmide. La disfunzione del plasmide è ottenuta mediante PCR mediante DNA-polimerasi estremamente nitide e ad alta fe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, México (numero di sovvenzione 154833) e Universidad Nacional Autónoma de México. Gli autori vogliono ringraziare Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos e Soledad Juárez per i loro consigli amministrativi e tecnici.
Materials
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304011 | Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products |
| High pure plasmid isolation kit | Roche | 11754785001 | Used for all plasmid purification reactions |
| High pure PCR product purification kit | Roche | 11732676001 | Used for all PCR purification reactions from agarose gels |
| AflII restriction enzyme | New England Biolabs | R0520L | Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3142L | Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C |
| SpeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3133L | Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C |
| XbaI restriction enzyme | New England Biolabs | R0145L | Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166-5G | Antibiotics |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N8878-5G | Antibiotics |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625-1KG | Bacterial cell culture |
| Casein peptone | Sigma Aldrich | 70171-500G | Bacterial cell culture |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | Sodium chloride |
| Agar | Sigma Aldrich | 05040-1KG | Bacterial cell culture |
| XbaI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0684 | Fast digest XbaI enzyme |
| KpnI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0524 | Fast digest KpnI enzyme |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Fast DNA ligation kit |
| AflII restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0834 | Fast digest AflII enzyme |
| SpeI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD1253 | Fast digest SpeI enzyme |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Vos, M. J., Kampinga, H. H. A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes. Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).
- Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination. Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 26 (1), 101-106 (1983).
- Gruber, T. M., Gross, C. A. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Curr Protoc Bioinformatics. , 1-22 (2002).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. CSHLP. , (2001).
- Rutherford, K., et al. Artemis: sequence visualization and annotation. Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).
