CAPRRESI：プラスミド回収および制限酵素部位挿入によるキメラアセンブリ
Summary
ここでは、同義語DNA配列への制限酵素部位の挿入および機能的プラスミド回収に基づくプロトコルであるプラスミド回収および制限酵素部位挿入（CAPRRESI）によるキメラアセンブリを提示する。このプロトコールは、タンパク質コード遺伝子を融合するための迅速かつ低コストの方法である。
Abstract
ここでは、プラスミド回収および制限酵素部位挿入（CAPRRESI）によるキメラアセンブリを提示する。 CAPRRESIは、元のプラスミド回収法の多くの利点から利益を得、制限酵素消化を導入してDNAライゲーション反応を容易にする（キメラアセンブリに必要とされる）。このプロトコルでは、ユーザーは野生型遺伝子を同じプラスミド（pUC18またはpUC19）にクローニングします。キメラが組み立てられるべきアミノ酸配列領域のin silico選択の後、ユーザーはそれらをコードするすべての同義語DNA配列を得る。 Ad Hoc Perlスクリプトを使用すると、ユーザーはすべてのシノニムDNA配列を決定できます。このステップの後、別のPerlスクリプトは、すべての同義語DNA配列上の制限酵素部位を検索する。このin silico分析はまた、pUC18 / 19プラスミド上に見出されるアンピシリン耐性遺伝子（ ampR ）を用いて行われる。ユーザは、野生型およびampR遺伝子をPCRによって破壊するために同義語領域内のオリゴヌクレオチドを設計する。 obtの後相補的なDNA断片を精製し、精製し、制限酵素消化を行う。適切な相補的DNA断片を連結することにより、キメラ構築が達成される。 CAPRRESIのために、小さいサイズ（2,686塩基対）、高いコピー数、有利な配列決定反応特徴および商業的入手可能性などの技術的利点を提供するため、pUC18 / 19ベクターが選択される。キメラ構築のための制限酵素の使用は、平滑末端生成物を産生するDNAポリメラーゼの必要性を排除する。 CAPRRESIは、タンパク質コード遺伝子を融合するための迅速かつ低コストの方法である。
Introduction
キメラ遺伝子アセンブリは、タンパク質機能を解明するため、および/またはバイオテクノロジー目的のために、分子生物学において広く使用されている。重複するPCR産物増幅1 、プラスミド回収2 、相同組換え3 、CRISPR-Cas9システム4 、部位特異的組換え5 、およびギブソンアセンブリ6のような、遺伝子を融合させるための異なる方法が存在する。これらはそれぞれ異なる技術的利点を提供します。例えば、重複PCR設計の柔軟性、プラスミド回収中の構築物のインビボ選択、またはCRISPR-Cas9およびGibsonシステムの高効率などである。一方、これらの方法のいくつかを実行している間にいくつかの困難が生じることがあります。例えば、最初の2つのアプローチは、平滑末端DNAフラグメントに依存しており、これらのタイプの産物のライゲーションは、sticに比べて技術的に困難であり得るky-endedライゲーション。 部位特異的組換えは、Cre- loxPシステム5のように、オリジナルに余分なDNA配列（傷跡）の痕跡を残す可能性があります。 CRISPR-Cas9は、標的部位4に加えて他のゲノム領域を修飾することがある。
ここでは、プラスミド回収法（PRM）と同義DNA配列に制限酵素部位を挿入し、ライゲーション効率を向上させたタンパク質コード遺伝子を融合させるプロトコールであるプラスミド回収と制限酵素サイト挿入（CAPRRESI）によるキメラアセンブリを紹介する。アミノ酸配列の完全性を保証するために、制限酵素部位を同義語DNA配列のストレッチ上に挿入する。 CAPPRESIの利点の中には、通常の実験用試薬/ツール（ 例えば 、酵素、コンピテントセル、溶液、サーモサイクラー）を使用して行うことができ、迅速な結果を得ることができるという点が挙げられます。制限に依拠する同義語DNA配列から出現する酵素部位は、目的のタンパク質内の正確な融合点の選択を制限し得る。そのような場合、重複するオリゴヌクレオチドを用いて標的遺伝子を融合させ、制限酵素部位をベクターの耐性遺伝子上に挿入しなければならない。
CAPRRESIは、7つの簡単なステップ（ 図1 ）からなる：1）クローニングベクターpUC18またはpUC19 6の選択 ; 2）融合される野生型配列のin silico分析; 3）キメラアセンブリおよびプラスミド破壊のための破壊領域の選択; 4）制限酵素部位を含む同義語DNA配列のin silico生成; 5）選択されたプラスミドへの野生型遺伝子の独立したクローニング; 6）PCRによるプラスミド破壊、続いて制限酵素消化;および7）DNA連結および細菌形質転換を用いたプラスミド回収。この技術によって産生されるキメラ遺伝子は、i番目のシーケンス。
pUC18 / 19ベクターは、小型（ すなわち、 2,686塩基対）、高コピー数、有利な配列決定反応特徴および商業的利用可能性などのクローニングおよびキメラアセンブリーに技術的利点をもたらす。ここでは、 大腸菌（Escherichia coli）宿主を用いて、バクテリアの培養物が安価で増殖が速いため、キメラを組み立てて取り扱う。このことを考慮して、最終標的プラスミドへの融合断片のその後のクローニングが必要となる（ 例えば、細菌におけるpRK415としての発現ベクターまたは哺乳類細胞におけるpCMVとしての発現ベクター）。
CAPRRESIは、2つの主要なシグマ因子遺伝子、 E. colirpoDおよびRhizobium etlisigAを融合させるために試験された。一次シグマ因子は、転写開始に関与するRNAポリメラーゼサブユニットであり、4つのドメイン（ すなわち、 σ1、σ2、σ3、およびσ4） 8からなる 。アミノ酸配列の長さrpoDおよびsigAによってコードされるタンパク質はそれぞれ613および685である。 RpoDとSigAは48％の同一性（98％のカバレッジ）を共有します。これらの一次シグマ因子は、領域σ2とσ3との間で2つの相補的フラグメントに分割された。キメラ01（RpoDσ1-σ2+SigAσ3-σ4）およびキメラ02（SigAσ1-σ2+RpoDσ3-σ4）の2つのキメラ遺伝子をこのデザインに従って組み立てた。 DNA融合産物は、配列決定によって確認した。
Protocol
Representative Results
Discussion
CAPRRESIはPRM 2の代替品として設計されました。元のPRMは強力な技術です。それは、選択された遺伝子の任意の部分に沿ったDNA配列の融合を可能にする。 PRMについては、野生型遺伝子を同じプラスミドにクローニングしなければならない。その後、プラスミド上に見出される野生型および抗生物質耐性遺伝子の内部にオリゴヌクレオチドを設計する。プラスミド破壊は、平滑?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はConsejo Nacional de Ciencia yTecnología、CONACYT、México（助成金番号154833）およびNacionalAutónomadeMéxicoの支援を受けました。著者はVíctorGonzález、Rosa I.Santamaría、Patricia Bustos、SoledadJuárezに感謝したい。
Materials
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304011 | Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products |
| High pure plasmid isolation kit | Roche | 11754785001 | Used for all plasmid purification reactions |
| High pure PCR product purification kit | Roche | 11732676001 | Used for all PCR purification reactions from agarose gels |
| AflII restriction enzyme | New England Biolabs | R0520L | Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3142L | Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C |
| SpeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3133L | Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C |
| XbaI restriction enzyme | New England Biolabs | R0145L | Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166-5G | Antibiotics |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N8878-5G | Antibiotics |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625-1KG | Bacterial cell culture |
| Casein peptone | Sigma Aldrich | 70171-500G | Bacterial cell culture |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | Sodium chloride |
| Agar | Sigma Aldrich | 05040-1KG | Bacterial cell culture |
| XbaI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0684 | Fast digest XbaI enzyme |
| KpnI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0524 | Fast digest KpnI enzyme |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Fast DNA ligation kit |
| AflII restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0834 | Fast digest AflII enzyme |
| SpeI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD1253 | Fast digest SpeI enzyme |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Vos, M. J., Kampinga, H. H. A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes. Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).
- Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination. Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 26 (1), 101-106 (1983).
- Gruber, T. M., Gross, C. A. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Curr Protoc Bioinformatics. , 1-22 (2002).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. CSHLP. , (2001).
- Rutherford, K., et al. Artemis: sequence visualization and annotation. Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).
