CAPRRESI: montagem de quimera por recuperação de plasmídeo e inserção de sítio de enzima de restrição
Summary
Aqui, apresentamos a montagem de quimera por recuperação de plasmídeo e inserção de site de enzima de restrição (CAPRRESI), um protocolo baseado na inserção de sites de enzimas de restrição em seqüências de DNA sinônimo e recuperação de plasmídeo funcional. Este protocolo é um método rápido e de baixo custo para a fusão de genes que codificam proteínas.
Abstract
Aqui, apresentamos a montagem da quimera por recuperação do plasmídeo e inserção do sistema enzimático de restrição (CAPRRESI). CAPRRESI beneficia de muitos pontos fortes do método original de recuperação de plasmídeos e introduz a digestão de enzimas de restrição para facilitar as reações de ligação de DNA (necessárias para a montagem da quimera). Para este protocolo, os usuários clonam os genes do tipo selvagem no mesmo plasmídeo (pUC18 ou pUC19). Após a seleção in silico de regiões de sequências de aminoácidos onde as quimeras devem ser montadas, os usuários obtêm todas as seqüências de DNA sinônimo que as codificam. Os scripts perl ad hoc permitem aos usuários determinar todas as seqüências de DNA sinônimo. Após este passo, outro script Perl procura sites de enzimas de restrição em todas as seqüências de DNA sinônimo. Esta análise in silico também é realizada utilizando o gene de resistência à ampicilina ( ampR ) encontrado em plasmídeos pUC18 / 19. Os usuários projetam oligonucleótidos dentro de regiões sinônimas para interromper genes de tipo selvagem e ampR por PCR. Depois do obtAinando e purificando fragmentos de DNA complementares, a digestão com enzimas de restrição é realizada. A montagem da quimera é conseguida ligando fragmentos de DNA complementares apropriados. Os vetores pUC18 / 19 são selecionados para CAPRRESI porque oferecem vantagens técnicas, como tamanho reduzido (2.686 pares de bases), alto número de cópias, características vantajosas de reação de sequenciação e disponibilidade comercial. O uso de enzimas de restrição para o conjunto de quimeras elimina a necessidade de polimerases de DNA que produzem produtos de extremidade contundente. CAPRRESI é um método rápido e de baixo custo para a fusão de genes que codificam proteínas.
Introduction
A montagem de genes quiméricos tem sido amplamente utilizada na biologia molecular para elucidar a função protéica e / ou para fins biotecnológicos. Existem diferentes métodos para a fusão de genes, tais como a ampliação de produto de PCR em sobreposição 1 , a recuperação de plasmídeo 2 , a recombinação homóloga 3 , os sistemas 4 de CRISPR-Cas9, a recombinação 5 dirigida ao local e a montagem 6 de Gibson. Cada um destes oferece vantagens técnicas diferentes; Por exemplo, a flexibilidade do design de PCR sobreposto, a seleção in vivo de construções durante a recuperação do plasmídeo ou a alta eficiência dos sistemas CRISPR-Cas9 e Gibson. Por outro lado, podem surgir algumas dificuldades ao executar alguns desses métodos; Por exemplo, as duas primeiras abordagens dependem de fragmentos de DNA de extremidade frouxa, e a ligação destes tipos de produtos pode ser tecnicamente desafiadora em comparação com a SticLigação com ky-ended. A recombinação direta do site pode deixar vestígios de seqüências de DNA extra (cicatrizes) no original, como no sistema CreWloxP 5 . CRISPR-Cas9 às vezes pode modificar outras regiões do genoma além do site alvo 4 .
Aqui, apresentamos a montagem de quimera por recuperação de plasmídeo e inserção de local de enzima de restrição (CAPRRESI), um protocolo para a fusão de genes codificadores de proteínas que combina o método de recuperação de plasmídeo (PRM) com a inserção de sítios de enzimas de restrição em sequências de DNA sinônimo, aumentando a eficiência de ligadura . Para garantir a integridade da sequência de aminoácidos, os sítios de enzimas de restrição são inseridos em trechos de seqüência de DNA sinônimo. Entre os benefícios do CAPPRESI, é que pode ser realizada usando reagentes / ferramentas de laboratório comuns ( por exemplo , enzimas, células competentes, soluções e termociclador) e que pode dar resultados rápidos (quando as enzimas apropriadas são usadas). Baseando-se na restriçãoOs sites enzimáticos que emergem de seqüências de DNA sinônimas podem limitar a seleção dos pontos de fusão exatos dentro das proteínas de interesse. Nesses casos, os genes alvo devem ser fundidos usando oligonucleótidos sobrepostos, e os locais de enzimas de restrição devem ser inseridos no gene de resistência do vetor.
CAPRRESI consiste em sete etapas simples ( Figura 1 ): 1) seleção do vetor de clonagem, pUC18 ou pUC19 6 ; 2) análise in silico das sequências do tipo selvagem a serem fundidas; 3) seleção de regiões de quebra para montagem de quimera e ruptura de plasmídeo; 4) geração in silico de sequências de DNA sinônimo contendo sites de enzimas de restrição; 5) clonagem independente dos genes do tipo selvagem no plasmídeo selecionado; 6) interrupção do plasmídeo por PCR, seguida de digestão com enzimas de restrição; E 7) recuperação de plasmídeo usando ligadura de DNA e transformação bacteriana. Os genes quiméricos produzidos por esta técnica devem ser verificados wSeqüenciamento.
Os vetores pUC18 / 19 oferecem vantagens técnicas para a clonagem e a montagem de quimeras, como tamanho pequeno ( ie, 2.686 pares de bases), número de cópias elevado, características de reação de seqüenciamento vantajosas e disponibilidade comercial 7 . Aqui, um hospedeiro Escherichia coli foi usado para montar e lidar com as quimeras porque as culturas bacterianas são baratas e crescem rapidamente. Diante disso, será necessária a clonagem subsequente dos fragmentos de fusão nos plasmídeos alvo finais ( por exemplo, vetores de expressão como pRK415 em bactérias ou pCMV em células de mamífero).
CAPRRESI foi testado para a fusão de dois genes primários do fator sigma: E. colirpoD e Rhizobium etlisigA . Os fatores sigma primários são subunidades de ARN polimerase responsáveis pela iniciação da transcrição e consistem em quatro domínios ( ie, σ1, σ2, σ3 e σ4) 8 . A sequência de aminoácidos lengtH de proteínas codificadas por rpoD e sigA são 613 e 685, respectivamente. RpoD e SigA compartilham 48% de identidade (98% de cobertura). Esses fatores sigma primários foram divididos em dois fragmentos complementares entre as regiões σ2 e σ3. Dois genes quiméricos foram montados de acordo com este projeto: quimera 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) e quimera 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). Os produtos de fusão de DNA foram verificados por sequenciação.
Protocol
Representative Results
Discussion
CAPRRESI foi projetado como uma alternativa ao PRM 2 . O PRM original é uma técnica poderosa; Ele permite a fusão de seqüências de DNA ao longo de qualquer parte dos genes selecionados. Para PRM, os genes de tipo selvagem devem ser clonados no mesmo plasmídeo. Depois disso, os oligonucleótidos são projetados dentro de genes de resistência de tipos selvagens e antibióticos encontrados no plasmídeo. A interrupção do plasmídeo é conseguida através de PCR utilizando polimerases de DNA…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia, CONACYT, México (número de concessão 154833) e pela Universidade Nacional Autônoma do México. Os autores agradecem a Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos e Soledad Juárez pelo seu conselho administrativo e técnico.
Materials
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304011 | Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products |
| High pure plasmid isolation kit | Roche | 11754785001 | Used for all plasmid purification reactions |
| High pure PCR product purification kit | Roche | 11732676001 | Used for all PCR purification reactions from agarose gels |
| AflII restriction enzyme | New England Biolabs | R0520L | Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3142L | Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C |
| SpeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3133L | Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C |
| XbaI restriction enzyme | New England Biolabs | R0145L | Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166-5G | Antibiotics |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N8878-5G | Antibiotics |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625-1KG | Bacterial cell culture |
| Casein peptone | Sigma Aldrich | 70171-500G | Bacterial cell culture |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | Sodium chloride |
| Agar | Sigma Aldrich | 05040-1KG | Bacterial cell culture |
| XbaI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0684 | Fast digest XbaI enzyme |
| KpnI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0524 | Fast digest KpnI enzyme |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Fast DNA ligation kit |
| AflII restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0834 | Fast digest AflII enzyme |
| SpeI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD1253 | Fast digest SpeI enzyme |
References
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